细胞外囊泡据其来源、大小、组成等分类为外显粒(35纳米)、外泌体（30-150nm）、微囊泡（100-1000nm）、凋亡小体（50-5000nm）。

人体中不同器官、组织以及不同类型细胞都能分泌外泌体，由于体积小（30-150nm）其可通过血液和体液进行转运和转移，因此外泌体中的不同分子物质被认为和肿瘤的转移以及心血管发生有关。同时由于外泌体可以双向穿过血脑屏障，也被认为和脑疾病发生和进展相关。更重要的是，外泌体经过分离、体外培养，通过和改良后的AAV（包裹靶向基因的小分子）进行整合，可以靶向到相关的组织细胞，并达到可能的基因治疗的作用。

因此，近年来外泌体的研究方兴未艾、风起云涌。通过搜集血液、使用抗体捕获心脑组织特有的外泌体并结合后续不同的平台（NGS或者其他MS、Olink微量定量蛋白质技术等方法）有可能发现更多的疾病的marker，进一步为心脑疾病（心脏病、AD和MDD）血液早筛提供可能。也有文献报道血清外泌体环状RNA可以区分癌症患者和健康个体，显示出外泌体具有作为癌症诊断标志物的潜力，也为肿瘤的液体活检提供无限的想象力。

但是外泌体的研究技术上也有很大的挑战，比如如何分离好的外泌体是后续研究的基石。相关的文献已经报道不同的分离方法不同程度地影响EV纯度、完整性、活性状态以及产量。

在这篇综述中，我们将关注外泌体的起源、组成和3种疾病（心血管、脑部疾病、肿瘤）的应用潜力以及方法的技术难题和挑战。

外泌体来源于细胞内质体结构，其起源于质膜内陷内质体的内吞作用（图1）。细胞膜凹陷和内吞形成早期内质体，内质体进一步内陷形成多泡体 (Multivesicular bodies，MVB) 。这而 MVB 内的许多囊泡，通常称为腔内囊泡 (Intraluminal vesicles ，ILV)。这些含有 ILV 的 MVB 经过降解途径形成溶酶体。部分经过特定的胞吐过程，最终与细胞膜融合将内囊泡释放到细胞外空间，即为外泌体。

图1. 外泌体和微囊生物起源、受体细胞摄取外泌体的途径

外泌体的组份相对稳定，包括蛋白质、脂类、代谢物、氨基酸、各种RNA和DNA。这些组份赋予外泌体对邻近或远端细胞的生物学效应。

外泌体的脂质成分包括鞘脂、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、饱和脂肪酸和神经酰胺，这些都在细胞膜中均存在，间接说明外泌体起源于细胞膜的内陷作用。

外泌体的蛋白质成分包括与膜运输相关的蛋白质，例如四跨膜蛋白（CD63、CD81、CD82 和 CD9），它们通过 ALIX 和 ESCRT-III 依赖性途径被招募到外泌体。外泌体还可以富含热休克蛋白（Hsp60、Hsp70 和Hsp90）、整合素和MHC II 类蛋白。

外泌体的RNA种类中，miRNAs和mRNA的研究最为深入。研究表明一些外泌体mRNA是完整的，可以在受体细胞中转化为功能蛋白。

外泌体DNA (exoDNA)可以包括单链或双链DNA形式的核DNA和线粒体DNA。

外泌体被证明是与心肌功能相关的生物信号的有效传播者(图2)。外泌体将其分子载体转移到受体细胞以调节细胞功能，其中涉及到与细胞的功能性通信可能涉及几种类型的相互作用，包括:1）在细胞外空间释放外泌体内容物;2）外泌体与受体细胞表面结合外泌体质膜融合;3）通过外泌体与靶细胞对接形成的连接蛋白通道直接转运产物;4）通过内吞作用摄取。

本文作者描述了外泌体来源的分子(主要是microRNA和蛋白质)对健康和疾病中的心脏功能的影响。同时，体外将外泌体包装改进成Exo-AAV作为将基因(如SERCA2a[肌浆/内质网Ca2+ ATPase 2a])传递到心肌细胞并产生相应的抗体且由于传统的AAV载体。这些都说明外泌体有可能作为心脏生物标志物或治疗手段的潜在应用。

图2：外泌体参与心肌功能相关的生物信号

图3：外泌体（EV）从中枢神经系统到外周血的转运图

已经报道的研究中外泌体（或者EV）在AD 和 PD的发病有着密切的关系，主要是在有毒蛋白质的清除中有着重要作用。研究结果显示，神经元细胞分泌EV的上调可增强神经小胶质细胞对Aβ的摄取，并显着降低Aβ的细胞外水平，将EV注射到AD转基因小鼠大脑，可显著降低大脑Aβ负荷，因此EV也被提出作为一种毒性减弱机制，消除过量的tau蛋白分泌。

另外，外泌体（或者EV）也在中枢神经系统疾病中有害蛋白的转运中发挥作用，在AD模型中，发现淀粉样前体蛋白 (APP)在裂解为Aβ肽的过程中，部分Aβ向多泡体转运，小部分Aβ与EV结合，分泌到细胞外空间。

综上所述，外泌体（或者EV）是重要的细胞间通讯和信号传导通路。其在神经系统中也起到许多功能，包括细胞间通讯、髓鞘形成的维持、突触可塑性、抗原呈递和神经元的营养支持。

例如当机体受到外来突变或者有害物质时，会启动免疫反应包括先天免疫反应和适应性免疫反应。而最近研究发现，树突状细胞(DC)和肿瘤源外泌体表达大量主要组织相容性复合体I类分子(MHC I)和肿瘤标志物如热休克蛋白(HSP)，它们参与抗原呈递和T细胞的刺激，并在体外和体内被证明可以触发CD8+ T细胞依赖性的抗肿瘤反应。

图4：外泌体参与肿瘤免疫反应的应答

 同时外泌体也可以作为体外基因的改造和包装的载体帮助免疫细胞启动下游的免疫反应。比如利用基因工程T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫疗法正在迅速成为一种有前途的新疗法。T细胞根据表型、表面受体和抗原特异性主要分为两种类型，包括CD4+辅助T细胞和CD8+ CTLs细胞。CD8+CTLs通过MHC I直接与抗原结合，增强细胞对细胞内病原体和恶性细胞的免疫。从CD4+辅助T细胞分离的外泌体包含外泌体相关蛋白(LAMP-1, TCR和LFA-1)和CD4T细胞标记物(CD4, TCR, LFA-1, CD25和FasL)，并参与CTL反应和抗肿瘤免疫。

因此，外泌体在免疫治疗中作为载体刺激抗癌免疫应答和作为免疫激活预测marker作用，同时基于外泌体的治疗是癌症免疫治疗的一种潜在新策略。

鉴于外泌体作为纳米囊泡的性质，可以跨越不同的生物屏障进行近端和远端的转移，外泌体已被作为各种分子的运输载体包括蛋白质和不同的RNA。一些研究发现，外泌体的摄取可能是细胞特异性的，这是药物输送的一个重要特征。例如，肿瘤细胞来源的外泌体含有特定的整合素，它可以引导外泌体分泌到特定的器官，一项早期研究表明，在前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌和胰腺癌模型中，表达αv整合素特异性肽的外泌体可以有效地将外泌体运送到αv整合素阳性的肿瘤中。此外，改造的小鼠树突状细胞产生表达神经元特异性肽RVG(狂犬病毒糖蛋白)的外泌体，可在静脉注射后特异性地将小干扰RNA (siRNA)运送到神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞；另一项研究也使用表达RVG的外泌体将miR-124传递到小鼠卒中模型的梗死部位，其他研究也采用了类似的工程方法。

越来越多的研究表明外泌体在复杂疾病和代谢疾病中的作用。由于其再生能力、免疫耐受性和免疫调节功能，来自间充质干细（MSC）的外泌体已在多项临床研究中作为治疗药物。人类 MSC 衍生外泌体的研究显示，在 MSC 外泌体治疗的第一周内，急性移植物抗宿主病症状显着减轻，并保持稳定4 个月。在另一项研究中发现用人脐带血来源的 MSC 外泌体治疗慢性肾病 (CKD) 患者可减轻炎症反应和 CKD 的进展。另外的一项临床试验评估人脐带血来源的 MSC 外泌体对1型糖尿病患者β细胞质量的影响。

因此，外泌体既可以作为不同疾病和不同生理状态的反应marker，也可以作为体外基因工程的工具对不同疾病不同器官进行治疗，显示出外泌体作为细胞间通讯介质，其生物标志物及治疗作用潜力无穷！