【J Exp Clin Cancer Res】中科大王昊团队成果，METTL16/SOGA1轴改变能量代谢产生乳酸促进结直肠癌

通过对两个独立的大规模全基因组范围内的CRISPR/Cas9敲除筛选数据集的分析，团队发现，在METTL家族成员中，METTL16是CRC细胞存活最重要的基因（图1A，B）。重要的是，在主要的m6A调节因子中，METTL16也在CRC的存活中显示出重要作用（图1C，D），表明其在CRC中的功能意义。TCGA和GEO数据库显示，与正常组织相比，METTL16在CRC组织中显著上调（图1E，F）。此外，TGGA数据显示METTL16表达与CRC的临床病理变量有关（图1G-I）。METTL16表达的增加与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和临床分期等级显著相关。CRC细胞系中的METTL16 mRNA表达也高于正常结肠上皮细胞（图1J）。类似地，CRC细胞系中的METTL16蛋白表达通常高于正常结肠上皮细胞（图1K，L）。此外，CRC样本和邻近非癌组织的免疫组化（IHC）染色结果进一步证实，METTL16在CRC组织中的表达增强（图1M和N）。METTL16蛋白表达增加与CRC患者的不良生存率相关（图1O）。此外，多变量Cox回归分析显示，METTL16蛋白表达可能是CRC患者生存的独立预测因子（图1P）。总体而言，METTL16在CRC中上调，并可能在CRC进展中发挥重要作用。

图1 METTL16在CRC中上调，并且与不良预后相关

为了研究METTL16在CRC进展中的作用，使用两种shRNAs（shM16-1，shM16-2）和一个pHBLV-METTL16载体（OEM16）分别在CRC细胞中敲低和过表达了METTL16。METTL16的敲低减少了CRC细胞的增殖和集落形成能力，而METTL16的过表达则产生了相反的效果（图2A-D）。同样，METTL16的敲低抑制了CRC细胞的迁移和侵袭能力，而METTL16的过表达则促进了CRC细胞的转移（图2E，F）。METTL16敲低和过表达的CRC异种移植瘤模型进一步评估了METTL16的功能，结果表明METTL16的过表达促进了肿瘤生长，而METTL16的抑制则抑制了肿瘤生长，这体现在肿瘤的大小、体积和重量上（图2G-L）。此外，METTL16敲低减少了Ki67（一种肿瘤增殖的标志物）的表达，而METTL16的过表达则在体内促进了Ki67的表达（图2M，N）。综上所述，这些结果表明METTL16在促进CRC进展中起着重要作用。

图2 METTL16在体外和体内促进CRC进展

图3 SOGA1被确定为METTL16的直接目标

为了探究导致SOGA1 mRNA被m6A修饰的机制，研究了m6A阅读器在调节mRNA修饰中的作用。已知m6A阅读器在调节mRNA修饰中扮演不可替代的角色。为了识别能够识别并结合SOGA1甲基化的m6A阅读器，从SW620细胞中进行了RNA pull-down实验以捕获与SOGA1相互作用的阅读器。实验发现，m6A阅读器YTHDF1和IGF2BP1/2/3能够与SOGA1 mRNA结合（图4A，B）。有趣的是，IGF2BP1的敲低显著降低了CRC细胞中SOGA1 mRNA和蛋白水平（图4C，D）。然而，YTHDF1和IGF2BP2/3的敲低对SOGA1蛋白表达没有明显影响（图4E-G）。TCGA数据分析显示，与正常组织相比，IGF2BP1在CRC组织中表达上调（图4H，I）。IGF2BP1表达的增加与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和临床分期等级显著相关（图4J，K）。ROC曲线显示，IGF2BP1表达可能是CRC发病的预测指标，并且IGF2BP1表达增加与CRC患者的不良生存率相关（图4L）。此外，RNA pull-down实验显示IGF2BP1蛋白与SOGA1 mRNA之间存在紧密的相互作用（图4M）。一致地，RIP实验的结果进一步确认了IGF2BP1直接结合SOGA1 mRNA（图4N）。由于IGF2BP1作为一个m6A阅读器主要调节mRNA稳定性，因此评估了IGF2BP1缺乏对SOGA1 mRNA衰变速率的影响。如图4O所示，IGF2BP1的敲低降低了SOGA1 mRNA的稳定性并提高了其在CRC细胞中的降解速率。综上所述，这些结果表明，被甲基化的SOGA1 mRNA能够被IGF2BP1直接识别，这种识别抑制了转录本的降解并通过依赖m6A的方式促进SOGA1的表达。

图4 SOGA1被IGF2BP1特别识别

SOGA1通过在肝细胞中抑制自噬参与葡萄糖代谢，糖酵解是癌症中葡萄糖代谢最重要的过程之一。因此，研究了METTL16/SOGA1轴对糖酵解的影响以促进CRC进展。在SW620细胞中敲低SOGA1显著减少了葡萄糖摄取和乳酸生产（图5A，B）。进一步地，SOGA1缺失的CRC细胞表现出降低的ECAR——这是整体糖酵解通量的指标，并且OCR增加，反映了线粒体氧化呼吸（图5C，D）。一致地，METTL16缺陷的CRC细胞显示出葡萄糖摄取减少（图5E）、乳酸生产减少（图5F）、ECAR减少（图5G）和OCR增加（图5H）。相比之下，在SW620细胞中过表达METTL16促进了葡萄糖摄取和乳酸生产（图5I，J）。为了进一步确定METTL16/SOGA1介导的糖酵解机制，测量了SOGA1敲低的CRC细胞中一系列与葡萄糖代谢相关基因的mRNA表达（图5K）。团队也研究了这些分子是否由METTL16控制，因此团队在过表达METTL16的CRC细胞中检测了这些基因的mRNA表达（图5L）。有趣的是，只有PDK4的表达水平在SOGA1敲低后显著下降，并且在METTL16过表达后一致地上升。通过进一步验证，团队发现敲低SOGA1和METTL16都减少了CRC细胞中PDK4的mRNA和蛋白表达（图5M-O）。PDK通过在多个位点的抑制性磷酸化来控制丙酮酸脱氢酶的活性，从而防止糖酵解产物进入三羧酸循环，同时也导致脂肪酸氧化的相应增加。作为分布最广的PDK同种型之一，PDK4被认为是最重要因素之一，通过指导碳流从氧化磷酸化（OXPHOS）转向糖酵解来调控葡萄糖代谢。几项重要的研究已经证明了PDK4在葡萄糖代谢中的关键作用。综上所述，团队的数据揭示了METTL16/SOGA1轴通过调控PDK4的表达在CRC细胞中促进糖酵解。

图5 METTL16/SOGA1轴通过靶向CRC细胞中的PDK4来增强糖酵解

团队进一步探讨了涉及SOGA1调控PDK4表达的潜在机制。据报道，AMPK信号是PDK4的关键上游调控因子。为了验证AMPK在PDK4表达中的作用，使用了AMPK激活剂A769662来刺激CRC细胞。结果显示，A769662诱导了AMPK（Thr172）的磷酸化，激活了AMPK信号，并显著减少了PDK4的蛋白和mRNA表达（图6A，B）。AMPK是一个由α催化亚基和β、γ调节亚基组成的三聚体。团队发现，敲低AMPKα1、β1和γ1亚基增加了PDK4的mRNA和蛋白表达（图6C，D），这表明AMPK位于PDK4的上游，并在CRC细胞中负向调控PDK4的表达。接下来，团队发现敲低SOGA1显著促进了AMPK的磷酸化及AMPKα1、β1和γ1蛋白的表达（图6F），但对AMPK α1、β1和γ1的mRNA表达没有明显影响（图6E），这表明SOGA1可能调控AMPK蛋白的稳定性。蛋白稳定性测定显示，SOGA1敲低减少了pAMPK、AMPKα1、β1和γ1的衰减，并增强了它们的蛋白稳定性（图6G）。先前的研究表明，AMPK可通过各种激酶如LKB1、CaMKK2和TAK1激活。然而，敲低LKB1、CaMKK2和TAK1对SOGA1缺失介导的AMPK磷酸化没有明显影响，这表明存在其他调控机制介导SOGA1激活AMPK。最近的一项研究揭示，环状RNA Circ-ACC1可以直接结合AMPKβ和γ亚基，从而促进AMPK的磷酸化和蛋白稳定性。类似地，Co-IP实验结果表明，SOGA1可以结合到pAMPK、AMPKα1、β1、γ1（图6H），并促进AMPK α1、β1、γ1和pAMPK的泛素化（图6I）。此外，抑制AMPKα1、β1和γ1部分逆转了SOGA1或METTL16缺失下调的PDK4表达（图6J）。综上所述，这些结果表明SOGA1结合AMPKα1、β1和γ1，诱导它们的泛素化并抑制它们的表达和磷酸化，从而促进PDK4的表达（图6K）。

图6 SOGA1通过抑制AMPK激活来调节PDK4的表达

为了探索CRC中高表达METTL16的潜在机制，团队通过分析ENCODE染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据在ChIPBase和PROMO中评估了负责调控METTL16的潜在转录因子（TFs）。如图7A所示，在由ChIPBase预测的26个TFs和由PROMO预测的46个TFs中，六个TFs——CEBPB、YY1、VDR、ETS1、TCF4和XBP1重叠。接下来，分别下调了这六个TFs，并发现CEBPB和YY1的敲低，而非其他TFs，增加了METTL16 mRNA的表达（图7B）。然而，CEBPB的缺失对METTL16蛋白表达没有明显影响（图7C）。YY1的敲低显著上调了CRC细胞中METTL16的蛋白和mRNA表达（图7D，E）。在分析METTL16基因启动子时，团队发现了其上的YY1结合位点，并设计了ChIP引物（图7F）。ChIP实验表明，YY1可以直接结合到CRC细胞中的METTL16启动子（图7G），这表明YY1是METTL16的上游转录因子。接下来，团队突变了METTL16启动子报告基因的两个潜在YY1结合位点，生成了pGL-M16-Mut1或pGL-M16-Mut2（图7H）。结果显示，si-YY1可以显著降低pGLM16-WT和pGL-M16-Mut1的荧光素酶水平，而si-YY1的抑制效果在pGL-M16-Mut2中减弱（图7I）。此外，YY1的敲低增加了CRC细胞中SOGA1 mRNA的稳定性（图7J）。综上所述，这些数据表明YY1是METTL16的上游转录因子，并通过直接结合其启动子来调控METTL16的表达。

图7 YY1转录调节CRC细胞中METTL16的表达

为了探讨SOGA1在METTL16介导的CRC增殖中的作用，团队在过表达METTL16的CRC细胞中使用siRNA下调了SOGA1的表达，并检测了细胞增殖。结果显示，SOGA1的敲低削弱了METTL16促进的CRC细胞增殖（图8A）。敲低AMPKα1、β1和γ1亚基以及过表达SOGA1显示了类似的作用，部分逆转了METTL16介导的CRC增殖。同样地，SOGA1的敲低部分抑制了METTL16促进的CRC细胞转移（图8B）。在体内实验中，SOGA1和PDK4的敲低都削弱了METTL16过表达所促进的肿瘤生长，表现为肿瘤大小（图8C）、体积（图8D）和重量（图8E）的变化。此外，METTL16和SOGA1的表达在CRC组织中呈正相关（图8F，G）。TCGA数据库也显示METTL16和SOGA1的mRNA表达之间存在显著的正相关。此外，METTL16的表达在CRC组织中与PDK4呈正相关（图8F）。重要的是，Kaplan-Meier分析表明，在CRC患者中，METTL16和SOGA1或METTL16和PDK4的高表达共现与不良预后呈正相关（图8H）。上述结果表明，SOGA1在METTL16介导的CRC细胞增殖中发挥了重要作用，并且METTL16/SOGA1轴在CRC患者中具有临床意义，且与不良预后相关。

图8 METTL16/SOGA1轴与CRC患者预后不良有临床相关性

综上所述，本研究表明METTL16在结直肠癌进展中的肿瘤促进作用。METTL16在结直肠癌组织中上调，与结直肠癌患者的预后不良有关。

相关具体生物机制为：在细胞核中，上游转录因子YY1通过直接结合甲基转移酶METTL16其启动子来调控METTL16的表达，METTL16的表达正向调控靶基因SOGA1，并通过增加靶基因SOGA1 m6a位点；携带有m6a位点SOGA1 释放到细胞质中，被特异性的阅读蛋白IGF2BP1阅读和识别进而调控SOGA1 表达，SOGA1通过抑制腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号来促进PDK4表达，最终改变正常细胞利用葡萄糖的模式，从“三羧酸循环”变为“糖酵解”产生乳酸诱导肿瘤的发生和恶性进展。‍‍‍‍‍‍‍

总之，METTL16 可能是一种 CRC 新的预后生物标志物和潜在治疗靶点，为探索新的CRC诊断生物标志物和治疗靶点提供了新的见解。

参考文献：Wei W, Zhang ZY, Shi B, Cai Y, Zhang HS, Sun CL, Fei YF, Zhong W, Zhang S, Wang C, He B, Jiang GM, Wang H. METTL16 promotes glycolytic metabolism reprogramming and colorectal cancer progression. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Jun 20;42(1):151. doi: 10.1186/s13046-023-02732-y.

【Environ Health Perspect】安徽医科大学徐德祥团队发现，孕期砷暴露Cyr61 m6A下调导致胎儿生长受限

【Exp Mol Med】南京大学医学院附属鼓楼医院蒋青/徐兴全团队成果，骨关节炎发病新机制和潜在治疗靶点

【Adv Sci】南京医科大学金晖/李建勇/范磊团队成果，m6A修饰circTET2与HNRNPC作用促进慢性淋巴细胞白血病进展