基于以上科研问题，2024年1月4日，南京鼓楼医院蒋青教授及徐兴全副教授团队在【Experimental & Molecular Medicine】杂志（IF：12.8），发表题为“WTAP-mediated m6A modification of FRZB triggers the inflammatory response via the Wnt signaling pathway in osteoarthritis”研究，首次揭示了WTAP的表达是OA中甲基转移酶上调最显著的，并通过其m6A催化活性促进软骨细胞变性、炎症和氧化应激。本研究详细阐述WTAP在OA进展中的新作用，确定其作为OA治疗的潜在靶点，为理解和治疗骨关节炎提供了新的科学依据。
研究背景
文献报道，OA易感基因的异常表观遗传改变与疾病的发生和发展有关，表明表观遗传机制在OA的发生或发展中起着至关重要的作用。常见的表观遗传修饰包括组蛋白修饰、DNA甲基化和非编码RNA调控，目前在OA中已被广泛研究。除了在DNA上进行可逆的化学修饰外，RNA上如m6A修饰是目前研究最深入的修饰之一。
RNA的m6A修饰主要由m6A甲基转移酶驱动，如METTL3、METTL14、WTAP和VIRMA等蛋白，被称为“writers”；被m6A去甲基化酶移除，如FTO和ALKBH5等蛋白，被称为“erasers”；又被m6A结合蛋白识别，如IGF2BPs、YTHDCs和YTHDFs等蛋白，被称为“readers”。虽然这种修饰在各种疾病中逐渐被发现，并影响疾病的发展，但只有少数研究表明软骨细胞中的m6A甲基化可能影响OA的进展。
有研究指出，Wnt（wingless-type）信号通路对软骨、骨骼和关节的发育至关重要，也与出生后关节稳态和疾病有关。典型的Wnt信号通路，包括β-catenin，已经在OA动物模型和OA患者中进行了广泛的研究。相关研究表明Wnt信号对关节和骨形成以及软骨维护是不可或缺的，这种表型是通过延长细胞存活时间和防止肥厚性分化来区分的。而FRZB（Frizzled-related protein)作为Wnt通路的抑制剂，可限制规范Wnt通路的激活。经典的Wnt/β-catenin信号通路在OA中异常激活，FRZB通过抑制Wnt通路有效缓解了OA的严重程度。另有报道称，Wnt/β-catenin信号通路受m6A甲基化调控，从而影响疾病进展。但是， 关于m6A甲基化是否有助于FRZB表达的变化，并影响OA下游Wnt通路的激活，这一系列问题尚需要更多研究证据来进行系统地阐述。
方案设计
1. 临床OA软骨及未受伤软骨样本MeRIP-Seq和RNA-Seq ：用于分析m6A修饰在OA中的作用并筛选下游靶基因。（Sequencing and multi-omics analysis by Genesky Biotechnologies Inc, Shanghai,）
2. 体外细胞实验：质粒及病毒转染的体外OA模型构建，用于研究软骨细胞的表型变化，解释WTAP在OA中的作用。
3. 小鼠动物模型构建及验证实验：免疫组化、免疫荧光、实时定量PCR、Western blot等技术方法，来验证WTAP在OA中的作用以及FRZB在OA中的表达和修饰情况。
主要内容&结果
1. 临床样本MeRIP-Seq发现WTAP显著表达和OA细胞验证
利用临床OA软骨和未受伤软骨组织样本检测m6A主要甲基化相关基因(METTL3、METTL14、WTAP、VIRMA、ALKBH5和FTO)的表达，结果表明WTAP是唯一表达显著上调的甲基化转移酶。并用促炎细胞因子TNF-α处理人类软骨细胞来成功诱导了OA细胞模型。发现在TNF-α刺激下软骨细胞ROS水平升高，且50 ng/ml TNF-α作用24 h的软骨细胞表现出最显著的OA表型，并通过对细胞OA模型中主要的m6A甲基化相关基因表达研究，证实了WTAP在骨关节炎软骨中高表达，并可能在骨性关节炎进展中发挥作用。如图1。
Figure 1. WTAP was upregulated in TNF-α-induced chondrocytes and osteoarthritic cartilage.
2. 过表达WTAP细胞模型验证，WTAP调节下游软骨细胞活性氧的产生
利用过表达WTAP (flag-WTAP)的质粒转染软骨细胞，综合qRT–PCR，Western blotting和免疫荧光检测结果，以及ADAMTS4、ADAMTS5、MMP13、IL-6、IL-8和iNOS的mRNA表达水平，及ADAMTS4、ADAMTS5和MMP13的蛋白水平变化情况。发现过表达WTAP后，MMP13在软骨细胞中显著增加，此外，过表达WTAP的软骨细胞中活性氧的产生较对照软骨细胞中显著增加。如图2。
Figure 2. WTAP overexpression aggravated the TNF-α-induced osteoarthritic chondrocyte phenotype.
3. 敲除WTAP细胞模型证实，WTAP调节下游软骨细胞炎症相关基因表达
用慢病毒转染软骨细胞敲除WTAP (KO-WTAP)并经过50 ng/mL的TNF-α处理。TNF-α处理对第7天的转染效率无影响，而KO-WTAP细胞模型在TNF-α处理后，WTAP mRNA和蛋白水平显著降低。敲除软骨细胞中的WTAP可降低m6A水平，并显著降低OA细胞模型中关节炎相关基因的mRNA (ADAMTS4、ADAMTS5、MMP13、IL-6、IL-8、iNOS)和蛋白水平。表明了WTAP参与骨关节炎软骨细胞表型。如图3。
Figure 3. Knocking out WTAP alleviated the osteoarthritic chondrocyte phenotype.
4. MeRIP-seq结合RNA-Seq挖掘m6A修饰下游靶点和通路
通过MeRIP-seq确定了临床OA软骨样本中m6A修饰的潜在下游靶点。发现有3886个基因的甲基化峰升高，且主要富集在外显子区(83.21%)，其次是3' UTR区(11.58%)。结合人OA软骨和未损伤软骨组织样本RNAseq数据，发现FRZB在骨关节炎软骨中高m6A修饰的表达下调最为显著。利用特异性m6A甲基化抑制剂DAA (50 μM)处理的软骨细胞，发现FRZB表达在DAA处理后被发现上调，而在细胞OA模型中FRZB表达下降。最终证明WTAP可能通过Wnt/β-catenin途径介导FRZB细胞的m6A修饰并调节骨关节炎软骨细胞表型。如图4。
Figure 4. The Wnt pathway inhibitor FRZB abnormally elevated m6A methylation in OA.
5. 正反向功能实验验证WTAP通过抑制FRZB表达激活Wnt/ β-catenin通路
Figure 5. The FRZB-Wnt/β-catenin axis was regulated by WTAP in chondrocytes.
6. 功能实验发现WTAP通过m6A修饰影响FRZB的稳定性，以促进骨关节炎软骨细胞分解代谢
使用50 μM甲基化抑制剂DAA处理，来研究FRZB m6A修饰和Wnt/β-catenin在flag-WTAP软骨细胞中的激活。qRT-PCR和Western blotting结果显示，经DAA处理后，FRZB的mRNA和蛋白表达在软骨细胞中显著上调，而Wnt/β-catenin的mRNA和蛋白水平受到抑制；相反地，在flag-WTAP软骨细胞中骨关节炎软骨细胞表型显著下降，包括关节炎相关基因(ADAMTS4、ADAMTS5、MMP13、IL-6、IL-8、iNOS)和ADAMTS4、ADAMTS5和MMP13蛋白水平下降。而ROS染色发现在DAA处理的flag-WTAP软骨细胞中活性氧水平降低。说明了WTAP通过m6A修饰影响FRZB的稳定性，以促进骨关节炎软骨细胞分解代谢。如图6。
Figure 6. WTAP regulated Wnt/β-catenin signaling activation and the osteoarthritic chondrocyte phenotype by m6A modification of FRZB.
7. 小鼠模型实验证实， WTAP通过β-catenin影响软骨的分解代谢变化及发育
通过在DMM手术诱导的OA小鼠模型关节内注射NC或腺相关病毒（AAV）siWTAP。Safranin O和fast green染色显示，经AAV siWTAP处理DMM诱导的OA小鼠的软骨表面有所改善，而NC AAV处理的软骨表面没有改善。另外，NC AAV显著提高了OARSI评分，而siWTAP治疗降低了OARSI评分。免疫组化显示细胞外基质ECM成分增加，说明注射AAV siWTAP缓解了OA小鼠模型软骨基质的退行性变化。通过SKL2001激活Wnt/β-catenin信号通路，发现siWTAP对骨关节炎软骨和OARSI评分的这些保护作用被消除。并通过开放场试验和足迹分析证实siWTAP抑制骨关节炎表型。论证了β-catenin通路有助于WTAP刺激骨关节炎软骨的分解代谢变化及发育。如图7。
Figure 7. WTAP inhibition alleviated OA progression through Wnt/β-catenin signaling inactivation.
研究意义与展望
【Adv Sci】南京医科大学金晖/李建勇/范磊团队成果，m6A修饰circTET2与HNRNPC作用促进慢性淋巴细胞白血病进展
【Environ Health Perspect】安徽医科大学徐德祥团队发现，孕期砷暴露Cyr61 m6A下调导致胎儿生长受限
【J Hematol Oncol】上海交通大学医学院附属瑞金医院沈柏用团队发现，LncRNA在胰腺癌免疫微环境中新功能和分子机制
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