【Environ Health Perspect】安徽医科大学徐德祥团队发现，孕期砷暴露Cyr61 m6A下调导致胎儿生长受限
文摘
科学
2024-06-18 15:58
江苏
胎儿宫内生长受限（FGR）是指胎儿受到各种有害因素影响而未能达到其遗传基因决定的全部生长潜能，临床上主要表现为低出生体重儿（LBW）和小于胎龄儿（SGA）。“成年疾病发育起源学说”认为，FGR是成年期肥胖症、II 型糖尿病及精神分裂症高发的重要原因。因此探明胎儿宫内生长受限病因机制对预防成年慢性疾病高发有重要意义。过去一直认为，孕期营养摄入不足是导致FGR的主要因素。然而，越来越多的证据表明，有害环境因素（镉、1-硝基芘和多氯联苯等）是FGR的重要危险因素。砷（As）是一类普遍存在于环境中的有毒类金属，主要通过人类活动释放到环境，如矿产开采冶炼、含砷农药和杀虫剂、木材防腐剂与涂料使用、工业生产过程使用。全球砷污染现象普遍存在，很多国家地下水砷浓度超过WHO饮用水标准限定值（< 10μg/L），全球约有1.4亿人饮用水受到砷污染。流行病学调查发现，母体砷水平与LBW和SGA呈正相关。然而，孕期砷暴露引起FGR的机制仍不清楚。
2023年9月8日，安徽医科大学徐德祥教授团队在环境与健康领域顶级期刊《Environmental Health Perspectives》（实时IF=11.03）上发表题为“Effects of Gestational Arsenic Exposures on Placental and Fetal Development in Mice: The Role of Cyr61 m6A”的研究论文，深入研究S-腺苷蛋氨酸耗竭所致Cyr61 m6A下调在孕期砷暴露抑制胎盘滋养细胞侵袭的作用，阐明了环境砷暴露诱发胎儿生长受限的机制。
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1. 动物模型：实验1：怀孕小鼠被随机分配到实验组（每组>11只），并通过饮水暴露于不同浓度的NaAsO2 (0.15, 1.5, 15 mg/L)；实验2：32只孕鼠随机分为4组（对照组、叶酸（FA）组、As组和As+FA组），As组和As+FA组暴露于NaAsO2 (15 mg/L)，所有怀孕的小鼠在GD18的早晨被麻醉，记录妊娠结果。然后，进行胎盘H&E染色、免疫印迹、SAM含量和m6A甲基化酶活性、转录组测序。2. 细胞模型：人类绒毛外滋养层细胞（HTR-8/SVneo细胞系），2 uM的NaAsO2共培养。通过CCK-8试剂盒测定活力，伤口愈合测定以评估细胞迁移能力，Trans-well进行迁移和入侵分析，免疫荧光、RT-PCR、Cyr61 mRNA稳定性、质粒转染等。3. 人群研究：采集妊娠早期孕妇的晨尿和血液。将血液离心获得血浆，用于测量As和CYR61水平。分娩后立即收集胎盘组织，部分胎盘组织固定在4%多聚甲醛中进行免疫组织化学。剩余的胎盘组织在液氮中冷冻，进行免疫印迹分析。
研究人员首先利用小鼠模型研究砷暴露对胎鼠及胎盘发育的影响，通过各种指标检测结果，发现砷暴露小鼠的胎儿（暴露于1.5和15 mg/L NaAsO2）和胎盘（暴露于15 mg/L NaAsO2）的大小均更小。进而研究妊娠期砷暴露对胎盘滋养层细胞间质侵袭的影响，发现15 mg/L NaAsO2暴露组与对照组相比，糖原+滋养层细胞积累增多，间质侵袭标志物表达降低，而叶酸补充缓解孕期砷暴露导致胎盘滋养细胞侵袭抑制和胎鼠宫内生长受限。![]()
结果二、参与砷引起的滋养层细胞侵袭的关键基因Cyr61
研究者利用转录组测序分析参与砷引起的滋养层细胞侵袭的关键基因，实验组和对照组筛选之后发现5个基因参与了滋养层功能调控，包括Sparcl1、Ceacam13、Ceacam3、TGF-b2和Cyr61。经过RT-qPCR、免疫组化和免疫荧光等实验证实了Cyr61表达在砷暴露组显著降低，作为潜在的候选靶点。
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研究者在细胞模型中分别过表达和敲低CYR61基因，利用细胞侵袭实验等证实了过表达后能够部分恢复砷引起的滋养层细胞侵袭下调的能力；而敲低后则抑制了HTR8/SVneo细胞的侵袭。在分子机制上，考虑到m6A修饰对mRNA稳定性的潜在影响，研究者分析了Cyr61中可能的m6A修饰位点，并利用MeRIP-qPCR证实了Cyr61的m6A修饰在暴露组中显著下调。考虑到m6A识别蛋白对mRNA稳定性的影响，利用RIP-qPCR证实IGF2BP2结合到Cyr61 mRNA上，其结合能力在砷暴露组显著降低。进一步寻找可能参与的m6A修饰相关的甲基转移酶或去甲基化酶，发现多个甲基转移酶在暴露组和对照组间无显著差异，而去甲基化酶Alkbh5在暴露组显著降低，另外m6A甲基转移酶活性也显著更低。SAM作为甲基化反应的甲基供体，利用LC-MS/MS确定了暴露组细胞内SAM更低。![]()
通过人群病例-对照研究证实，AGA（适龄胎儿）和SGA（低龄胎儿）婴儿的母体尿As浓度和血浆CYR61含量，孕早期孕妇尿砷浓度和血浆CYR61水平之间呈负相关。免疫组织化学显示，SGA婴儿胎盘CYR61阳性细胞的百分比低于AGA婴儿。接下来，比较AGA和SGA胎盘中的表达量。如图8F所示，SGA胎盘中几种侵袭相关蛋白（波形蛋白、MMP2和MMP9）的水平低于AGA胎盘。此外，在SGA婴儿中，母体尿As浓度与血浆叶酸含量之间存在显著的负相关。![]()
1. 妊娠期砷暴露通过抑制滋养层细胞的迁移和侵袭，导致滋养层细胞侵袭缺陷和FGR。2. 体内外实验均支持模型中Cyr61下调参与砷诱导的滋养层细胞迁移和侵袭抑制。3. 分子机制：Cyr61下调归因于Cyr61 m6A修饰导致Cyr61 mRNA的稳定性下降。原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37682722/
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