蜘蛛利用球状淀粉样结构域的结构转换来制造结实的丝纤维

Spiders Use Structural Conversion of Globular Amyloidogenic Domains to Make Strong Silk Fibers

 

研究背景

蜘蛛丝是一种可持续的蛋白质基材料，以其卓越的机械性能而闻名。蜘蛛丝是由蜘蛛丝蛋白组成的，它是由位于蜘蛛腹部的专门的丝腺合成和分泌的。至少有七种不同的蜘蛛丝存在，每一种蜘蛛都被用来纺一种特定的丝或胶。

研究摘要

研究内容

与非重复末端结构域相比，各种蜘蛛的重复区域显示出不同的结构。对于I型蜘蛛蛋白，即MaSp、MiSp和FlSp，AlphaFold预测富含Gly、Ala和Pro的基序缺乏特定的折叠结构，表现为非结构化构象（图1d）。在Flag丝中，小间隔区(9aa)预计采用β线结构。据预测MiSp间隔区采用由5个α螺旋组成的结构，并且这种结构在不同蜘蛛物种的MiSp间隔区中是保守的。在II型蜘蛛群中，尽管PySp、AcSp和TuSp亚基之间的序列相似性非常低，但其三级结构十分保守。PySp、AcSp和TuSp的亚基都折叠成α螺旋（图1d和图2a）。AlphaFold预测的AcSp和TuSp的结构与相关的NMR结构具有显著一致性。AgSg的重复序列在结构上与PySp、AcSp和TuSp有显著差异，因为采用双层β折叠结构的预测具有良好的效度（图1d）。

图1 利用AlphaFold对脑室草不同蜘蛛结构域的结构预测。a)不同蜘蛛丝的结构。b)不同蜘蛛蛛和胶的NT结构域的AlphaFold结构预测。颜色条显示基于pLDDT置信度的AlphaFold着色对话框。虚线框表示确定的NMR结构。c)不同蜘蛛蛛和胶的CT结构域的AlphaFold预测。颜色条显示基于pLDDT置信度的AlphaFold着色对话框。虚线框表示核磁共振确定的结构。d)不同蛛丝和胶的重复区域和间隔区域的AlphaFold结构预测。颜色条显示基于pLDDT置信度的AlphaFold着色对话框。黄色的示意图箭头表示β线。

图2 基于大腹园蛛蜘蛛丝末端结构域、重复区域和间隔区域的不同蜘蛛的进化类群。a) PySp、AcSp2和TuSp1重复区亚基的结构比较。箭头表示AcSp亚基的额外螺旋。b)基于重复区(rep)和间隔区序列的大腹园蛛的系统发育分析。虚线圈突出显示MiSp。MiSp_spacer与PySp_rep、MiSp_spacer与AcSp_rep、MiSp_spacer与TuSp_rep的结构比较显示在进化组中。c)基于末端结构域组合的不同大腹园蛛的系统发育分析。虚线圈突出了MiSp。分支值表示引导值。

虽然MiSp间隔结构域是一种特定的进化添加，但II型间隔结构域在I型MiSp中发生的生物学功能尚不清楚。在大肠杆菌中重组产生大腹园蛛MiSp间隔域，并与硫氧还蛋白(Trx)标签融合，随后使用固定化金属亲和层析(IMAC)、反IMAC（凝血酶裂解后）和大小排斥层析(SEC)纯化。该纯化过程产生了纯度高的无标记蛋白（图3a）。由此产生的重组间隔域是单个的，并且折叠成一个主要的α螺旋（图3b）。重组间隔蛋白的熔化温度为≈50℃（图3c）。暴露在较高的温度下发生变性，转变成随机线圈结构。圆二色性分析显示，大腹园蛛重组间隔蛋白从pH5.5到7.5范围内，二级结构和热稳定性无明显变化（图3b,c）。在pH 8.0时，重组间隔蛋白呈单体构象，电喷雾电离质谱（ESIMS，图3d）证实，当pH从8.0降至5.5时，重组间隔蛋白仍保持稳定。

大腹园蛛MiSp间隔蛋白在静息条件下过夜孵育期间不是保持单体状态，而是形成了大的聚集体。原生质谱法证实了可溶性物种的完全消失，显示出与聚集物存在相关的基线升高（图3d）。淀粉样蛋白特异性染料硫黄素T (ThT)染色显示聚集体呈阳性，提示存在淀粉样原纤维。在从单体到聚集体的转变过程中，二级结构经历了从α螺旋到β折叠构象的转变（图3g）。透射电镜(TEM)显示存在淀粉样原纤维，直径约为10 nm（图3h）。这表明重组大腹园蛛MiSp间隔蛋白在静态条件下具有在较宽pH范围内的生理缓冲液中自组装成淀粉样原纤维的能力。

为剖析淀粉样蛋白原纤维的形成机制，在37°C和不同初始单体浓度的静态条件下对重组MiSp间隔物进行了一系列ThT测量（图3e）。最终的荧光强度与浓度呈线性关系初始单体浓度，表明ThT准确地报告了反应过程。对于所有测试浓度的重组MiSp间隔结构域，动力学轨迹的形状都是双曲线，这表明依赖单体的二次成核和依赖寡聚物的聚合似乎都不是限速步骤。此外，在数据归一化后，不同间隔剂浓度下的聚集轨迹重叠，这表明不同浓度下的聚集常数相同，提示非核依赖的聚集机制，类似于重组MiSp和AcSp重复区和CT结构域。不同重组间隔蛋白浓度的聚集轨迹被全局拟合（图3e），并且可以用模型聚合和构象变化这两个术语很好地描述（图3f），其中k_r为1.9 × 10⁻¹¹ M⁻¹ s⁻¹,k_c为1.1 × 10⁻⁹ M⁻¹ s⁻¹。

图3 重组大腹园蛛 MiSp间隔域的表征。a)重组MiSp间隔物的凝胶过滤和SDS-PAGE分析。b)重组间隔物在pH 7.5、6.5和5.5下的CD谱图。c)温度诱导的重组MiSp间隔物的展开。d)重组MiSp间隔物在37°C、pH 8.0、7.0和5.5下孵育前后的ESI-MS光谱。e)在20 mmol L⁻¹ NaPi pH 8.0、37℃、静态条件下，1.0、2.0、4.0、5.0、7.0和8.0 μmol L⁻¹条件下重组MiSp间隔物的聚集动力学。f)重组间隔区归一化荧光动力学(图e)。聚合项用浅蓝色虚线表示，构象项用绿色虚线表示，它们的和用深红色实线表示。g) 37℃ pH 8.0孵育前后重组间隔物的CD谱图。h) pH 8.0条件下重组MiSp间隔物的透射电镜图像。i,j) pH 8.0条件下剪切力作用下重组MiSp间隔物的光镜图像。箭头表示丝状纤维。

在10 mmol L⁻¹Tris pH 7.5溶液中，以不同浓度的重组NMC或NMSC蛋白用尖拉纤维（图4c,d）。无论最初测试的蛋白质浓度如何，重组NMSC蛋白都成功地生成了丝状纤维（图4d）。而即使初始浓度高达20 mg mL⁻¹，重组NMC蛋白也没有形成纤维（图4c）。这些结果表明，MiSp间隔结构域在促进嵌合蜘蛛组装成丝状纤维方面起着重要作用。此外，在pH 7.5，2.5 mg mL⁻¹的浓度下，重组NMSC蛋白自组装成直径约为10 μm的纤维（图4e）。相比之下，重组NMC没有表现出任何丝状纤维形成的迹象。在pH 5.0时，重组NMSC蛋白形成的丝状纤维数量明显增加，而在测试的蛋白浓度和pH水平下，NMC没有表现出明显的丝状纤维形成。

图4 嵌合蜘蛛在NMC和NMSC中的自组装。a,b) NMC和NMSC嵌合蜘蛛的结构示意图。c,d) pH 7.5不同浓度下NMC和NMSC的自组装。e)重组NMC和NMSC在pH 7.0的Eppendorf管中自组装。黄色箭头表示丝状纤维。通过倒置荧光和扫描显微镜对丝状纤维成像。

在100、80、50和30mg mL⁻¹的100%六氟异丙醇(HFIP)中制备了冻干重组NMC或NMSC蛋白溶液。将这些蛋白在37℃下孵育数小时，随后离心以去除未溶解蛋白。收集含有重组NMC或NMSC蛋白的上清液作为湿纺丝原料（图5a）。将不同浓度的重组NMC和NMSC纺丝到由不同浓度的甲醇组成的混凝浴中。当蛋白浓度较低（30 mg mL⁻¹）时，使用90%和100%的甲醇浓度从重组NMSC蛋白中纺出丝状纤维。但无论使用的甲醇浓度如何，NMC都没有产生纤维。在较高的蛋白浓度下（80和100 mg mL⁻¹），重组NMC和NMSC蛋白在不同的甲醇浓度下都可以纺成丝状纤维。为比较NMC和NMSC纤维的力学性能，选择了80 mg mL⁻¹的蛋白质浓度和85%的甲醇浓度。在这些条件下，NMSC和NMC蛋白都能够产生丝状纤维，可以收集和测试（图5b）。

NMSC纤维直径(≈14 μm)小于NMC纤维直径(≈20 μm)（图5c）。这表明MiSp间隔结构域的存在可能促进纤维中蛋白质链的更紧密排列。继续测量重组NMC和NMSC丝状纤维的力学性能（图5d）。与NMC纤维相比，NMSC纤维表现出更高的强度和韧性（图5e-i）。NMSC纤维的平均强度可达352±123 MPa，是NMC纤维(124±89 MPa)的2.8倍（图5e-g）。然而，NMC和NMSC纤维的延展性相似（图5h）。这些结果表明，MiSp隔离域可以提高纤维的机械强度，而不会显著影响其拉伸性。利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)对纤维进行了二级结构分析。虽然与NMC纤维相比，NMSC纤维中β折叠的含量略有增加（图5j），这两种蛋白质纺成的纤维的二级结构含量无显著差异。使用共聚焦激光扫描显微镜观察纤维的内部特征。如图5k，NMC纤维沿纤维轴方向显示出许多暗区。NMSC纤维的荧光更加均匀，未观察到明显大暗区。这些结果表明MiSp间隔域可以改善相关纤维的本征分子均匀性。

图5 重组蚕丝纤维的制备与表征。a)纺丝装置示意图。b)重组NMC和NMSC丝状纤维的共聚焦成像。c) NMC和NMSC丝状纤维的直径。d)在纸框架上收集具有代表性的NMC和NMSC丝样纤维样品进行力学测试。e、f)湿法纺丝制备的重组NMC和NMSC丝样纤维的应力-应变曲线。g-i)重组NMC和NMSC蛋白制备的丝状纤维的机械应力、应变和韧性的比较。j) NMC和NMSC纤维的二级结构含量，由它们在酰胺I区的吸收光谱决定。k)NMC和NMSC纤维的共聚焦激光扫描显微镜图像，基于其固有荧光进行可视化。

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