Self-cascade deoxynivalenol detoxification by an artificial enzyme with bifunctions of dehydrogenase and aldo/keto reductase from genome mining
确保食品安全的需求被认为是一个全球性问题。霉菌毒素可污染全球约25%的粮食和饲料作物产量，是产毒曲霉属、镰刀菌属和青霉属的次生代谢产物，可引起严重的广泛植物病害，并评估对人类和动物的严重健康风险。其中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是分布最广的霉菌毒素，主要污染谷物和谷物制品，可导致食欲障碍、免疫抑制、恶心和呕吐。因此，构建有效的方法来控制DON污染对人类和动物的食品安全至关重要。
近年来，各种物理和化学解毒方法被开发出来，包括吸附、氩等离子体和臭氧处理。鉴于传统的物理和化学方法具有较低的消除能力和潜在的有害化学残留物，生物降解是一种有吸引力的策略，可以可持续地控制酶和微生物对DON的污染。降解酶已被确定为最有前途的解毒方法。由于C3羟基部分是 DON 毒性的主要决定因素，因此已广泛研究了 C3 上氧化和差向异构化的酶以降解 DON。不同菌株的醛酮还原酶AKR18A1、DON差向异构化酶DepA、与DepA相似度为100%的醌依赖性DON脱氢酶QDDH和脱氧雪腐镰刀菌烯醇脱氢酶DDH可有效将DON转化为3-酮-DON。此外，DON差向异构化酶DepB、醛酮还原酶AKR6D1和来自不同菌株的AKR13B2负责将3-酮-DON转化为3-epi-DON。然而，这些酶的稳定性不足是食品和饲料加工过程中实际应用的重要限制。由于来自不同微生物的酶表现出不同的酶特性，因此希望从不同微生物中挖掘新的DON降解酶，以丰富DON降解的资源库。
研究摘要
Devosia菌株是一类多样化的细菌，由于体内有一组DON降解酶，具有很高的DON降解能力。Devosia 菌株 A6-243 是一种实验室菌株，即使在 42 °C 下也能将 DON 转化为 3-epi-DON，表现出高转化率。为了鉴定出具有高稳定性的DON降解功能酶，首先对Devosia菌株A6-243的基因组进行了测序，并在COG功能、GO功能和KEGG通路分类中进行了注释（图1 A）。其全基因组包括3736个蛋白质编码基因和1346个催化活性相关基因，是挖掘DON降解酶的基础池。为了探索新型DON降解酶，首先将A6-243菌株的测序基因组与具有直接降解DON能力的Devosia突变体17-2-E-8的基因组进行比较。如图1B所示，1179个蛋白质编码基因在A6-243和17-2-E-8之间保守。然后，将这1179个保守基因与仅能将3-酮-DON降解为3-epi-DON的Devosia riboflavina IFO13584基因组进行了进一步比较。结果，1179个基因中有95个在IFO13584菌株中明显缺失，这表明这95种酶可能负责将DON氧化成3-酮-DON。同时，在3个菌株中保守的1179个基因中，左913个可能参与了将3-酮-DON还原为3-epi-DON（图1B）。
图1 通过比较分析揭示了DON降解的候选基因鉴定。（A）基因组的圆形图谱。从外到内依次为：基因组大小、正链基因、反链基因、正链ncRNA基因、反向链ncRNA基因、重复序列、GC含量、GC偏斜。（B） Devosia 菌株 A6-243、Devosia mutans 17-2-E-8 和 Devosia riboflavina IFO13584 基因编号的维恩图。（C、E）候选基因的COG分类分析。（D） 根据功能注释鉴定 A6-243 和 17-2-E-8 特有基因中假定将 DON 氧化为 3-酮-DON 的脱氢酶。（F）根据功能注释，在3株菌株中保守的基因中鉴定出催化3-酮-DON为3-epi-DON的醛-酮还原酶。
基于上述分析，在大肠杆菌宿主中表达来自A6-243菌株的2种PQQ依赖性喹蛋白脱氢酶（GL000018和GL001686），以巩固其特性。在SDS-PAGE上，GL000018和GL001686的分子量分别约为95和65 kDa，与理论分子量一致。纯化后，GL001686（命名为DADH）显示出将DON降解为3-酮-DON（图2A）的DON降解能力，而GL000018则没有DON降解能力。DADH的酶学性质在图2中测量。在20至60 °C的宽温度范围内测量DADH的相对活性，最适温度为40 °C（图2B）。在热稳定性方面，DADH出人意料地稳定，在4至40°C孵育6小时后仍保留>80%的残留比活性，在50°C孵育3小时后仍保留57.47%的残留比活性（图2C）。此外，在6.0至10.0的宽pH范围内研究了DADH的相对活性，在pH 7.5时比活性最大（图2D）。正如预期的那样，DADH在pH 6.0–10.0下孵育12小时后仍保持>60%的残留比活性（图2E）。根据酶动力学分析，K++m和 V麦克斯DADH值分别为296.53 μM和0.83 nM·h−1·微克−1蛋白质。总而言之，这些结果证明DADH是一种潜在的降解酶，具有先进的比活性和稳定性。
图2 DADH的酶学性质和潜在的催化机制.（A）DON（上图）和DADH体外DON氧化产物（下图）的HPLC图谱。（B）温度对DADH比活性的影响。（C）DADH在不同温度下孵育的热稳定性。（D） pH值对DADH比活性的影响。（E）DADH在不同pH值下在4°C下孵育12小时的pH稳定性，通过残留比活性测定。（F） DADH的模型结构和分子对接。（G） 具有单位点突变的DADH突变体的相对特异性活性。
图 3.AKR13B3的酶性质和潜在的催化机制.（A） 3-酮-DON（上图）和体外3-酮-DON AKR13B3还原产物（下图）的HPLC图谱。（B）温度对AKR13B3比活度的影响。（C）在不同温度下孵育AKR13B3的热稳定性。（D） pH值对AKR13B3比活性的影响。（E）在4 °C下在不同pH下孵育12 h的AKR13B3的pH稳定性，通过残留比活性测定。（F）AKR13B3的模型结构和分子对接。（G）具有单位点突变的AKR13B3突变体的相对特异性活性。
在上述筛选中，两种负责有效降解DON的酶被鉴定为DON到3-酮-DON的脱氢酶DADH和醛-酮还原酶AKR13B3 3-酮-DON转化为3-epi-DON。辅酶PQQ对DADH比活性的参与和NADPH对AKR13B3比活性的参与推动了人们对其合理供应的关注，因为较大的NADPH袋被较小的PQQ占据（图4A）。为了验证这一预测，我们开始努力检测供应PQQ对AKR13B3特定活动的影响。正如预期的那样，AKR13B3通过添加PQQ完全失活，有或没有辅因子Ca2+和DADH酶（图4B）。此外，随着PQQ浓度在20 μM以上的增加，AKR13B3的比活性急剧下降（图4C），在20 μM PQQ时保持约80%的相对比活性。同时，在20μM的PQQ浓度下，DADH可以保留约80%的相对比活性。如图4D和E所示，DADH和AKR13B3反应可以将DON降解为3-epi-DON，并且3-epi-DON的积累与DON在孵育过程中的消失相匹配。我们的酶级联留下的毒性不低的中间体3-酮-DON，而QDDH、AKR13B2和AKR6D1级联实现了3-酮-DON和3-epi-DON等比例的并存。上述结果表明，DADH和AKR13B3级联可以高效地将DON降解为3-epi-DON。
图 4.通过DADH 和AKR13B3级联将 DON 组合酶促降解为 3-epi-DON。（A）PQQ（蓝色）和NADPH（品红色）辅因子的结构。（B）外源性因素对AKR13B3比活性的影响。（C）PQQ浓度对AKR13B3比活性的影响。（D）DON（上图）的HPLC图谱以及DADH和AKR13B3级联的体外DON降解产物（下图）。（E） DADH 和AKR13B3 级联在 18 小时内消耗 DON 和积累 3-epi-DON。
研究通过聚焦基因组挖掘从Devosia菌株A6-243中发现了两种用于DON降解的新型酶。一种酶 DADH 被鉴定为第 1 步 DON 降解为 3-酮-DON，具有用于质子转移的保守 D289 催化碱基的 PQQ 依赖性脱氢酶。另一种酶AKR13B3作为NADPH依赖性醛酮还原酶，用于第二步3-酮-DON降解为3-epi-DON，催化D61、Y66、K91和H133的保守催化四分体。这两种酶都具有先进的比活性和稳定性，分别负责两步降解DON过程，显示出较高的DON降解效率。更重要的是，融合DADH-AKR13B3首先被设计用于一步DON降解。据我们所知，DADH-AKR13B3作为单一酶可以直接将DON降解为3-epi-DON，促进DON和3-酮-DON的双组分反应，兼具氧化和还原功能。此外，DADH-AKR13B3 能够在小麦样品中生物转化 DON，对农产品表现出高 DON 转化率。总的来说，这项研究为DON降解级联的多个步骤提供了一种罕见的双功能融合酶，突出了在食品工业中实际应用的潜在经济和技术可行性。
撰稿：孙宇轩
校稿：曹少攀
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