Direct and
Specific Detection of Glyphosate Using a Phosphatase-like Nanozyme-Mediated
Chemiluminescence Strategy
DOI： 10.1021/acs.analchem.2c05198文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c05198
有机磷农药作为杀虫剂和除草剂广泛应用于农业生产，在提高作物产量和品质方面发挥着重要作用。然而，有机磷农药的过量和不合理使用必然会在作物中产生不可避免的残留，对人类产生致癌损害、致畸或神经毒性，威胁人类健康和生态系统安全。因此，OP残留已成为世界各国监管部门关注的焦点。为了保护环境和人类健康免受有机磷残留的潜在危害，有必要开发准确可靠的传感器来检测有机磷。到目前为止，已经开发了多种检测OP残留物的方法，包括荧光、电化学和比色法。例如，我们的团队开发了一种基于共掺杂MXene纳米酶的乙酰胆碱酯酶(AChE)介导的OPs均相电化学检测方法。Wei的团队报告了一种使用杂原子掺杂石墨烯作为比色探针的OPs比色方法遗憾的是，上述策略存在以下缺点:首先，大多数OPs传感器都是基于OPs对AChE或丁基胆碱酯酶(BChE)活性的抑制，导致成本相对较高，存储稳定性较低；二是OPs对AChE或BChE活性的抑制作用缺乏特异性，不能满足OPs准确、特异监测的要求；第三，OP传感器的信号转换通常依赖于酶解产物，如硫胆碱，在实际环境中容易氧化变质，导致精度低，甚至出现假阳性结果。因此，为了解决上述问题，设计和开发新型传感器来实现无酶、特异性和准确的OPs检测是非常必要的。
为了解决上述问题，我们以Zr基MOF
(UIO-66)为前体合成了一种羟基氧化锆纳米酶(ZrOX-OH)，并利用合成的纳米酶构建了一个CL传感器，用于敏感、精确、选择性地检测OPs。ZrOX-OH具有优异的类磷酸酶活性，可水解DXD衍生物，生成金刚烷和电子激发的荧光团羟基苯甲酸盐离子，在470
nm处发射CL光子。有趣的是，ZrOX-OH的磷酸酶样活性对草甘膦表现出独特的反应，能够抵抗其他OPs的干扰。草甘膦是应用最广泛的OPs之一，可以通过消耗ZrOX-OH表面与ZrOX-OH磷酸酶样活性密切相关的羟基来抑制ZrOX-OH的磷酸酶样活性，阻止AMPPD的水解反应产生CL信号。因此，一种直接和特异性检测草甘膦的CL传感器很容易实现。此外，本文提出的CL检测方法避免了需要生物酶参与、选择性差、准确性低等缺陷，为实际样品中草甘膦的直接分析提供了一种新的方法。文献报道的有机磷农药(OP)传感器大多依赖于有机磷对乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的抑制作用，存在有机磷缺乏选择性识别、成本高、稳定性差等缺点。本文基于UIO-66易碱溶液处理得到的多孔羟基氧化锆纳米酶(ZrOX-OH)，提出了一种具有高灵敏度和特异性的直接检测草甘膦(一种有机磷除草剂)的化学发光(CL)策略。ZrOX-OH表现出优异的类磷酸酶活性，可催化3-(2′-螺金刚烷基)-4-甲氧基-4-(3′-磷酰氧基苯基)-1，2-二氧杂环丁烷(AMPPD)去磷酸化，生成强CL。实验结果表明，ZrOX-OH的类磷酸酶活性与其表面羟基的含量密切相关。有趣的是，具有磷酸酶样性质的ZrOX-OH对草甘膦表现出独特的反应，因为草甘膦独特的羧基消耗了表面羟基，因此被用来开发一种CL传感器，可以直接和选择性地检测草甘膦，而不使用生物酶。白菜汁中草甘膦的检测回收率为96.8
~ 103.0%。我们认为，基于具有磷酸酶样性质的ZrOX-OH的CL传感器为OP测定提供了一种更简单、更高选择性的方法，并为开发用于实际样品中OPs直接分析的CL传感器提供了一种新的方法。
ZrOX-OH的合成过程如图1A所示。根据文献报道的溶剂热法首次制备了UIO-66。通过X射线衍射(XRD)技术验证了UIO-66的形成(图1B)。透射电子显微镜(TEM)图像显示UIO-66颗粒呈现均匀分散的纳米球形形貌(图S1)。UIO-66的Brunauer
- Emmett - Teller (BET)表面积为1196.59 m2 g−1(图S2)。然后，将合成的UIO-66作为前驱体，在NaOH溶液中超声处理12
h，制得类似磷酸酶的纳米酶ZrOX-OH，其中的配体通过碱性溶液处理去除。通过XRD对ZrOX-OH产物的结晶度进行表征(图1B)，观察到平坦的衍射峰，显示出非晶态结构。然后用TEM研究ZrOX-OH的形貌(图1C)。ZrOX-OH表现出与UIO-66前驱体相似的大小和形状，表明在碱性处理过程中，UIO-66的形态和结构没有受到破坏。如图1D所示，ZrOX-OH的傅里叶变换红外(FT-IR)光谱显示，在2967
cm−1附近有一个明显的Zr−OH拉伸峰，这与UIO66前驱体中3500
~ 3000 cm−1处的水分子配位的宽带明显不同。UIO-66的FT-IR表征显示，在1406
cm−1处有一个明显的特征峰，与有机连接体中COO−基团的振动相对应，而ZrOX-OH的峰值在FT-IR光谱中消失。X射线光电子能谱(XPS)曲线显示，经碱性溶液处理后，C的含量明显降低(图1E)。图S3为UIO66和ZrOX-OH的一组高分辨率XPS光谱(C1s、O1s和Zr3d)。ZrOX-OH和UIO-66的Zr三维光谱几乎相同(图S3A,D)。但ZrOX-OH的C1s和O1s高分辨XPS光谱与UIO-66有显著差异，说明UIO-66经过碱性处理后化学结构发生了变化。结果表明，在碱性条件下，UIO-66中的有机配体被OH
-取代，然后UIO-66转化为表面存在大量羟基的ZrOX-OH。能量色散X射线光谱(EDX)结果也表明，ZrOX-OH的主要元素是Zr和O，只有微量的碳存在，进一步表明UIO-66前驱体中的有机配体被明显去除(图S4)。采用氮气吸附-解吸等温线对ZrOX-OH的多孔结构进行了研究。ZrOX-OH的BET表面积为277.23
m2 g−1(图S5)。结果表明，碱溶液处理得到的ZrOX-OH仍保持多孔结构。这为维持纳米酶的高催化活性提供了重要的前提条件。此外，ZrOX-OH的ζ电位为-
40.2 mV，而UIO-66的ζ电位仅为6.4
mV(图1F)。结果表明，经碱性溶液处理后，ZrOX-OH表面存在大量的−OH基团，使ZrOXOH带负电荷。同时，ZrOX-OH也表现出良好的分散性(图S6)。综合以上分析结果，可以得出ZrOX-OH纳米材料已经成功合成，具有多孔结构丰富、比表面积大、分散性好等特点，可以使底物分子迅速扩散，加速类似磷酸酶的催化水解反应活性。![]()
图1
(A) ZrOX-OH的合成。(B) 模拟UIO-66、合成UIO-66和ZrOX-OH的XRD谱图。(C)
ZrOX-OH的TEM图像。(D)
UIO-66和ZrOX-OH的FT-IR光谱。(E)
UIO-66和ZrOX-OH的XPS测量。(F)
UIO-66和ZrOX-OH的ζ-电位。
为了确认ZrOX-OH的磷酸酶样活性，采用4-甲基伞形花酰磷酸(4MUP)作为典型荧光底物进行荧光测定。如图2A所示，4-MUP由于其磷酸基团的存在，荧光信号非常微弱。使用另一种底物，即4硝基苯基磷酸(p-NPP)，进行了紫外-可见试验，以进一步验证ZrOX-OH的磷酸酶活性。纯p-NPP由于其磷酸基团而表现出非常弱的吸光度，这与UIO-66存在时的结果一致。在反应体系中引入ZrOX-OH后，p-NPP被催化水解生成对硝基苯酚(图S7A)，对硝基苯酚吸光度较大(图S7B)。实验结果表明，ZrOX-OH确实具有类似磷酸酶的活性，可以水解底物中的磷酸基。
如上所述，UIO-66前体没有类似磷酸酶的活性，只有经过碱性溶液处理后才能水解磷酸基生成ZrOX-OH。其原因可能是ZrOX-OH表面的富-OH作为亲核剂攻击带正电的磷原子，导致P
-O键断裂。因此，可以推断出ZrOX-OH表面的−OH在磷酸酶样活性中起着非常重要的作用。为了评估ZrOX-OH表面的-OH与磷酸酶活性之间的关系，我们探索了pH和有机酸对ZrOX-OH纳米酶活性的影响。如图2C所示，当溶液pH值从7.0到1.0变化时，ZrOX-OH催化的4-MUP的荧光强度逐渐降低，但当溶液pH值从7.0到11.0变化时，荧光信号达到平台期并保持较强，说明高浓度的氢离子会消耗ZrOX-OH表面的−OH，降低其类磷酸酶活性。并用乙酸(AA)、草酸(OA)、柠檬酸(CA)等有机酸处理ZrOX-OH，考察其纳米酶活性。如图2D所示，酸处理后ZrOX-OH的类磷酸酶活性急剧下降，说明有机酸也会与羟基发生反应，降低ZrOX-OH的类磷酸酶活性。这些结果表明，磷酸酶样活性的大小与ZrOX-OH表面羟基含量的高低密不可分。为了进一步探索ZrOX-OH的催化选择性，我们使用了其他底物，如p-NPP、双(4
-硝基苯基)磷酸酯(B-NPP)、4-硝基苯基乙酸酯(p-NPA)和4-硝基苯基硫酸盐(p-NPS)进行了紫外可见实验。这些物质的化学结构如图S8所示，它们包含三种化学键:C−O,
P−O和S−O。图2E的紫外可见光谱显示，含有S−O键和C−O键的P
- NPS和p-NPA的吸光度较小，而含有P−O键的P
- NPP的吸光度明显高于其他三种底物。需要指出的是，BNPP虽然也含有P−O键，但它属于磷酸二酯，不能被ZrOX-OH催化水解。这些结果表明，ZrOX-OH对磷酸单酯中P−O键的水解具有良好的选择性。为了量化ZrOX-OH的磷酸酶样活性，使用不同的p-NPP浓度(从0.1到1
mM)进行表观稳态动力学分析。如图2F所示，确定了典型的Michaelis
- Menten曲线。根据Lineweaver−Burk方程，计算得到ZrOX-OH的Michaelis常数(Km)和最大反应速度(Vmax)分别为124.6
μM和2.99
× 10−7 M s−1，表明ZrOX-OH对物质具有较高的亲和力。这些实验结果表明，基于其优异的去磷酸化活性，可以利用合成的ZrOX-OH来开发CL传感器。![]()
图2（A）不同条件下4-MUP的荧光光谱。（B）由ALP、ZrOX-OH和UIO-66催化的4-MUP水解反应。（C）反应系统的荧光强度随pH值而变化。（D）在AA、OA和CA存在的情况下，反应系统的荧光强度。（E）在ZrOX-OH存在的情况下，p-NPP、B-NPP、p-NPA和p-NPS的紫外光谱。（F）ZrOX-OH的稳态动力学分析。
接下来，利用AMPPD作为典型的CL底物，开发了一种基于ZrOX-OH磷酸酶样活性的新型CL传感器(图3A)。由于磷酸基团的存在，AMPPD的CL信号几乎消失(图3B)。当磷酸基被ALP水解生成adamantan2-one和电子激发的荧光团间氧苯甲酸盐离子时，AMPPD可以发出强烈的CL信号(图S9)。我们用合成的ZrOX-OH取代ALP，催化AMPPD中磷酸基的水解，观察到明显的CL强度，而仅存在ZrOX-OH或AMPPD时获得弱CL强度(图3B)。值得注意的是，研究了不同浓度ZrOX-OH对62.5μM AMPPD CL行为的影响。从图3C、D可以看出，随着ZrOX-OH浓度的升高，CL强度也相应增加。同时，ZrOX-OH在储存7天后仍表现出出色的催化活性(图S10)。这些实验结果证明了基于ZrOX-OH纳米酶优异的去磷酸化活性开发CL传感器的可行性。![]()
图3（A）拟议CL传感器的示意图。（B）传感器在不同条件下的CL响应。（C）传感器对应于不同浓度ZrOX-OH的CL响应：0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5和2.75mg
ml-1。（D）CL强度与ZrOX-OH浓度。
研究内容三：基于ZrOX-OH纳米酶的CL传感器原理基于ZrOX-OH的磷酸酶样活性及其独特的性质，我们开发了一种灵敏、选择性、无酶的草甘膦CL检测平台。草甘膦是农业生产中应用最广泛的广谱有机磷农药之一。在众多农药残留中准确检测草甘膦对环境和人体健康具有重要意义。如图4所示，当添加其他种类的OPs时，不影响ZrOX-OH的类磷酸酶活性。这主要是因为草甘膦特定的羧基消耗了ZrOX-OH表面的羟基。根据前一节的讨论，ZrOX-OH表面羟基的损伤会降低ZrOX-OH的类磷酸酶活性，使ZrOX-OH不能催化AMPPD的去磷酸化而产生CL信号。由于ZrOX-OH的类磷酸酶活性取决于草甘膦的含量，因此可以利用ZrOX-OH纳米酶催化的去磷酸化反应构建直接特异感知草甘膦的CL传感器。![]()
图4 用于直接和特异性草甘膦检测的CL分析示意图。
研究内容四：ZrOX-OH纳米酶CL传感器的分析性能在探索草甘膦的敏感性和选择性检测之前，首先对所提出的CL传感器的实验条件，如AMPPD浓度和pH进行优化，结果如图S11所示。在优化条件下，通过测定不同剂量草甘膦加入反应体系时的CL反应，考察了CL传感器在草甘膦分析中的分析性能。随着草甘膦用量从0μM增加到100μM, CL强度相应降低(图5A、B)。草甘膦测定法的检出限(LOD)为0.33μM (S/N = 3)，与之前报道的大多数方法(包括比色法、荧光法和电化学法)相当或更小(表S1)。如此高的性能可能是由于ZrOX-OH的高磷酸酶样活性及其独特的目标识别猝灭机制。综上所述，基于ZrOX-OH纳米酶的CL传感器具有无酶、选择性好、灵敏度高的优点，是一种很好的草甘膦传感策略。为了探索基于ZrOX-OH纳米酶的CL传感器的选择性，我们分析了一些商业OPs(如草甘膦、马拉硫磷、甲硫磷、硫辛硫磷、毒死蜱和对硫磷)(图5C)。如图5D所示，只有草甘膦显示了可忽略的CL信号，而除草甘膦外的OPs均获得了高强度的CL信号。这主要是因为只有草甘膦能够抑制ZrOX-OH的类磷酸酶活性，而其他OPs则没有这种抑制作用。此外，在草甘膦与其他OPs共存的条件下，进一步进行了选择性实验。如图S12所示，当草甘膦与其他OPs混合时，得到的CL信号始终较弱，而不含草甘膦的OPs混合时CL信号较强。实验结果表明，草甘膦能显著降低AMPPD的水解发光效应，对ZrOX-OH的磷酸酶样活性有极好的特异性抑制作用。此外，我们还研究了实际环境中可能存在的一些干扰，以证明基于ZrOx
- oh的CL传感器的抗干扰能力(图S13)。当基于ZrOX-OH纳米酶的CL传感系统中存在K+、Na+、Mg2+、Ca2+和葡萄糖等可能的干扰时，产生的CL信号几乎不受草甘膦监测的影响，表明所提出的CL传感器具有良好的抗干扰能力。
为了评估基于ZrOX-OH纳米酶的CL传感器在实际样品中草甘膦分析中的性能，采用所提出的测定方法对卷心菜汁进行了检测。如图5E所示，未添加草甘膦的白菜汁稀释后对CL强度几乎没有影响，而添加草甘膦的白菜汁CL强度明显降低。此外，增加草甘膦浓度会进一步降低白菜汁样品的CL信号。采用标准添加法进一步评价所提CL法的性能(表S2)。回收率为96.8
~ 103.0%，相对标准偏差在3.71%以内。可接受的结果证实了所提出的CL传感器在实际样品中的痕量草甘膦分析中具有出色的准确性、可靠性和精密度。![]()
图5（A）传感器对不同浓度的草甘膦的CL响应：0、1、5、10、20、40、50、60、80和100微米。（B）CL强度和草甘膦浓度之间的线性曲线。（C）废旧OP的结构。（D）CL传感器的选择性实验。（E）传感器在不同条件下的CL响应：（a）ZrOX-OH，（b）ZrOX-OH
+卷心菜汁，（c）ZrOX-OH
+草甘膦（25μM）+卷心菜汁，以及（d）ZrOX-OH
+草甘膦（100μM）+卷心菜汁。
综上所述，我们开发了一种简单的模板导向碱溶液处理方法来制备ZrOX-OH纳米酶，该纳米酶具有优异的磷酸酶样活性，并已被用于开发直接和特异性检测草甘膦的CL传感器。本文提出的CL传感器具有以下优点:首先，它不需要使用AChE，从而避免了高成本和低稳定性的缺点;二是CL传感器能够特异性检测草甘膦，具有抵抗其他类型OPs干扰的能力，实现特异性OPs的准确检测;第三，基于ZrOX-OH纳米酶的CL传感器实现了草甘膦的直接选择性测定，LOD为0.33μM，并成功应用于实际样品中草甘膦的监测，可靠性高。这种CL传感方法具有重要的意义，因为它不仅提供了一种实用的高选择性OP传感方法，而且为开发能够直接识别OPs而不使用生物酶的高性能CL传感器开辟了新的领域。
![]()
