Investigation into the impact of enzyme treatment on
the structural characteristics of egg yolk protein and its correlation with flavor
constituents
DOI：10.1016/j.foodhyd.2024.109851https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2024.109851
食品的风味被认为是影响消费者接受度的关键因素。蛋黄因其营养、乳化和凝胶形成特性而广泛用于各种食品中。在食品工业中，热处理已广泛用于加工蛋制品。然而，蛋黄在热处理过程中产生的不良气味（鱼腥味、海洋味或甲壳类气味）会对蛋制品的感官特性产生负面影响。这主要归因于蛋白质和脂质氧化。作为食品中的重要成分，蛋白质可以通过特定的分子键与风味化合物相互作用，从而影响食品中风味的强度。研究表明，食物蛋白质不具有任何固有的风味；然而，当在高温下与风味物质结合时，它们可能会影响这些物质在最终产品中的保留，从而对其感知风味产生重大影响。人们发现，大豆蛋白、β-乳球蛋白和猪肌原纤维蛋白可以与风味成分相互作用，从而改变食物的风味。最近，许多研究都集中在酶法对蛋白质风味的影响，因为它们能够改变蛋白质构象并随后影响蛋白质风味结合特性。本研究的目的是通过添加木瓜蛋白酶、脂肪酶和风味蛋白酶来增强EYG的风味特征，同时研究EYG的结构特性与其感官属性之间的关系。评估了不同类型的酶对风味的影响。此外，还确定了酶处理对蛋黄蛋白二级结构、表面疏水性和巯基含量的影响。采用偏最小二乘判别分析（PLSDA）和相关分析来评估 EYG 与其风味成分之间的相互作用。
研究了三种不同酶处理对蛋黄蛋白结构和挥发性化合物的影响。使用紫外光谱 (UV)、傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱、游离巯基分析和气相色谱-质谱 (GC-MS) 对二级和三级结构以及挥发物进行了表征。FTIR分析显示分子间、分子内和分子间反平行 β-折叠的含量减少，而无规卷曲增加。α-螺旋和β-转角的含量没有表现出显着变化，表明蛋白质紧密度降低。酶处理导致蛋黄热凝胶 (EYG) 内疏水相互作用、静电相互作用和氢键形成的增加。结构表征表明，EYG在脂肪酶水解（LEYG）后形成了大而均匀的气室空腔，而木瓜蛋白酶（PEYG）和风味蛋白酶（FEYG）水解的EYG表现出更致密的结构。此外，蛋白质与风味物质的结合抑制了挥发性风味化合物的释放。这些发现为通过调节蛋黄的蛋白质结构来增强蛋黄的风味和质地提供了见解。
研究内容一：酶处理对挥发性风味成分的影响
使用HS-SPME-GC-MS分析评估了酶处理对EYG风味的影响（图1A）。正如预期的那样，随着热处理，醛、酸、酮和醇等挥发性风味成分的含量显着增加，导致EYG的气味增强。值得注意的是，EYG样品中检测到高含量的不良醛类，包括己醛、庚醛、辛醛和苯甲醛。然而，酶处理有效降低了己醛、庚醛、辛醛和苯甲醛的含量，从而改善了EYG的整体风味特征。此外，酶处理诱导蛋黄分子空间构象的改变，促进其与多种风味化合物的相互作用，从而改善风味。
研究内容二：酶治疗对电子鼻的影响
为了设计DNA编码的合成生物标志物用于体内疾病传感，作者利用肿瘤微环境中电子鼻能够对样品中的挥发性成分进行全面分析，从而有助于更好地了解酶水解对EYG整体风味特征的影响。如图1B所示，DF1和DF2的贡献率达到98.861%，从而反映了四个样品的综合气味特征。电子鼻分析结果表明，酶水解有可能改变EYG的风味，其中脂肪酶的功效最高，其次是木瓜蛋白酶。FEYG 和EYG之间存在一定程度的一致性，表明它们具有相似的风味特征。原因可能是酶解会改变蛋白质的结构，而不同的酶具有不同的切割位点，导致酶解产物不同，从而形成不同的风味。结合 GC-MS 分析结果，很明显，风味蛋白酶的加入导致 EYG 中存在的挥发性气味化合物（如庚醛、苯甲醛和 2-戊基呋喃）减少。因此，这种减少有助于减少异味，同时使EYG的特征风味成分不受影响并保持消费者的可接受性。
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图1 酶处理对EYG风味特性A)电子鼻B) 质地C）硬度和粘性D）弹性和内聚性的影响EYG、PEYG、LEYG和FEYG的硬度值分别为2806.41、1020.43、407.01和1448.856。胶度值分别为1534.72、208.76、89.78和444.26。测量的弹性值为EYG为2.33，PEYG为0.32，LEYG为0.19，最后FEYG为0.40，而内聚性值被确定为等于或大约等于：EYG -0.54；PEYG-0.20；LEYG-0.22；FEYG-0.30（图1C和D）。酶处理后，EYG 的硬度、粘性和内聚性显着降低。这一过程促进了蛋黄分子结构的扩张，增强了蛋白质与水的相互作用，减弱了蛋白质与蛋白质的相互作用。因此，凝胶硬度下降。凝胶的内聚性是评价其网络结构完整性的关键参数，直接反映其抗压缩能力。然而，添加木瓜蛋白酶、脂肪酶和风味蛋白酶后，EYG 的内聚性显着下降。这种减少阻碍了凝胶网络的形成和稳定性。
人们发现风味分子和蛋白质之间的相互作用会破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，导致形成较弱的凝胶。三种酶酶解后，EYG 中小分子肽的产量增加，可能导致在热处理过程中产生额外的风味成分。这种现象破坏了蛋白质分子之间的疏水相互作用，从而导致凝胶硬度降低。考虑到GC-MS分析和硬度测量的结果，可以推断EYG的醛含量最高，这可能有助于其优异的硬度。研究内容四：酶处理对表面疏水性的影响
表面疏水性可以作为蛋白质分子表面疏水基团存在的指标。H0在蛋白质稳定性、构象和功能方面的重要性已得到充分证实。如图2A所示，酶水解导致蛋白质表面疏水性增加，表明其三级结构发生了变化。一方面，酶水解诱导蛋白质分子展开，从而暴露更多的疏水基团。另一方面，未折叠的蛋白质分子表现出对风味化合物的亲和力增强，导致表面疏水性的改变。木瓜蛋白酶和风味蛋白酶都表现出相似的效果，而脂肪酶则显着改善了表面疏水性。木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的存在（它们都能裂解蛋白质内的肽键）以及脂肪酶对酯键的作用，可以解释这种现象。
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图2 酶处理对EYG表面疏水性(A)、游离巯基(B)、zeta电位(C)和粒径(D)的影响研究内容五：酶处理对游离巯基的影响
游离巯基含量的变化对应于内部二硫键的变化。 如图2B所示，EYG、PEYG、LEYG和FEYG的游离巯基含量分别为：158.31、211.74、220.86和237.35。木瓜蛋白酶、脂肪酶和风味蛋白酶的添加显着增加了游离巯基的水平。 结果表明，酶处理引起蛋白质空间结构的构象变化，导致巯基暴露增加。该观察结果与表面疏水性的变化一致。新暴露的游离巯基在分子内部或分子之间相互作用，促进新型二硫键的形成。因此，酶水解处理增强了蛋黄分子的展开程度，有利于其与风味物质的相互作用，减少了EYG的异味。
研究内容六：酶处理对zeta电位和粒径的影响
负zeta电位是由于蛋黄中存在大量带负电荷的磷酸基团造成的。较高的 zeta 电位值表明蛋白质聚集和蛋白质分散。样品的zeta电位如图2C所示，EYG、PEYG、LEYG和FEYG的电位分别为-0.93、-0.85、-0.24和0.68。酶处理导致 zeta电位值增加，表明蛋黄分子的结构改变和表面极性残基的暴露增加。酶水解产生肽片段也可能促成这种潜在的变化。这种改变促进了与风味物质的结合，导致周围空气中挥发性风味物质的浓度降低，从而减少了EYG散发的异味，这与游离巯基的发现一致。风味蛋白酶处理有可能提高蛋黄蛋白的展开程度，促进挥发性风味化合物与蛋白质的结合，同时最大限度地减少EYG中不良风味的存在。 GC-MS结果进一步证实了这一观察结果。粒度分布如图2D所示。与对照组相比，酶处理导致蛋黄粒径减小。这种现象可能是由于酶处理破坏了蛋黄内的蛋白质聚集体，导致颗粒尺寸减小。具有增加的比表面积的较小颗粒更容易结合风味成分并防止其逸出。这也可能是酶处理减少EYG异味的原因之一。研究内容七：酶处理对分子间力的影响
一般来说，蛋白质凝胶化是由分子相互作用驱动和维持的，例如离子键、氢键和疏水相互作用。EYG的浊度最低，酶处理显着提高了EYG在SDS中的溶解度。这一观察结果表明，酶处理通过诱导暴露更多疏水基团的结构变化来促进EYG内的疏水相互作用，这与从表面疏水性获得的结果一致。尽管随着SDS浓度的增加，EYG的浊度并未表现出显着变化，但随着SDS浓度的增加，酶促修饰导致浊度成比例增加（图3A）。这可能归因于酶解EYG和其他风味成分之间的弱疏水相互作用。随着SDS浓度的增加，更多的酶解EYG分子与SDS结合，导致浊度增加。然而，由于与EYG分子结合的挥发性风味成分较少且它们之间的相互作用相对稳定，因此SDS浓度的增加对浊度的影响很小。 如图3B所示，EYG表现出最低的浊度，酶处理增强了EYG的浊度。研究结果表明，酶处理诱导蛋白质变性，从而增强蛋白质之间以及蛋白质与挥发性风味成分之间的静电相互作用，从而提高系统浊度。该观察结果与zeta电位结果一致。尽管随着NaCl浓度的增加，EYG 的浊度变化可以忽略不计，但酶解EYG的浊度却显着降低。这种现象可能是由于 NaCl 破坏了酶解EYG 与风味成分之间的静电相互作用，导致浊度降低。此外，这些结果进一步支持风味成分和蛋黄蛋白之间存在静电相互作用。总之，酶处理增强了EYG内的静电和疏水相互作用。这可能归因于酶处理诱导的蛋白质去折叠，导致具有暴露的带电基团和疏水区域的松散结构，并且还破坏了凝胶硬度和内部结构。此外，未折叠的蛋白质更容易结合某些风味化合物，从而减少气味感知。添加不同浓度的尿素后，酶处理样品的浊度增加（图 3C），与EYG相比，FEYG、LEYG和PEYG的浊度明显更高。虽然已知氢键的增加可以增强凝胶强度，但二硫键仍然是蛋黄凝胶形成的主要作用力。因此，对游离巯基的分析表明，酶处理后二硫键减少，最终导致硬度下降。
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图3 酶处理对EYG分子间作用力的影响
研究内容八：酶处理对紫外光谱的影响
分子间相互作用可以引起复合纳米粒子的紫外线吸收特性的改变。采用紫外光谱可以全面了解蛋白质-化合物结合机制，记录了200至600 nm的特征紫外光谱（图4A）。274 nm 处的峰对应于芳香族氨基酸（Trp、Phe和Tyr）的特征吸收。从图4A中可以看出，酶处理增强了274 nm处的蛋白质峰强度，表明芳香氨基酸与周围环境的暴露增加。这提供了酶处理诱导蛋黄分子展开的证据，这与我们之前的发现一致。208nm附近的峰表现出不同程度的波动，表明酶处理扰乱了蛋白质微环境并改变了其构象。值得注意的是，酶处理不仅增强了蛋白质吸收，还引起吸收峰蓝移。紫外光谱也有效地表征了结合机制。蛋白质-醛复合物的形成通过静态猝灭引起蛋白质紫外光谱的改变。因此，酶处理显着改变了蛋黄蛋白的吸收光谱，这可能是由于未折叠的蛋白质基团和醛类风味物质之间的相互作用所致。
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图4 酶处理对EYG紫外光谱 (A)、FTIR(B)和二级结构(C)的影响研究内容九：酶处理对蛋白质二级结构的影响
4个样品的FTIR光谱如图4B所示。FTIR光谱显示没有出现新的官能团； 然而，峰位置发生了明显的变化，表明酶处理引起了蛋白质二级结构的改变。两个光谱均表现出与蛋白质相关的特征峰，包括由C双键O键伸缩振动产生的酰胺I带（1700–1600cm−1）、由N-H键变形振动产生的酰胺II带（1550–1500cm−1）和 酰胺III带源自C-N键伸缩振动和N-H键变形振动（1300-1200cm−1）。此外，观察到酰胺A谱带 (3750-3000 cm−1) 中存在与O-H和N-H拉伸相关的振动。值得注意的是，酶处理显着增强了酰胺A区域内蛋白质的吸收光谱强度，表明蛋黄分子发生了结构修饰。木瓜蛋白酶和脂肪酶处理对EYG表现出更明显的影响，表明与N-H基团相互作用的氢键数量更多。蛋黄蛋白的主要二级结构是分子内β-折叠结构，这与我们的结果一致（图4C）。所有治疗组中分子间和分子内β-折叠以及分子间反平行β-折叠的比例均呈现下降，而无规卷曲的含量则有所增加。然而，α-螺旋和β-转角含量没有观察到显着变化。这些观察结果可能归因于蛋白质上疏水区域的暴露导致分子内氢键的形成，这与我们的表面疏水性和分子间力结果一致。此外，无规卷曲含量的增加表明蛋白质分子向无序状态转变，导致凝胶硬度降低。此外，酶处理通过改变蛋黄蛋白的二级结构来增强蛋黄蛋白的变性程度，从而产生更松散的蛋白质构象，可以与更多风味化合物结合并增强EYG的香气。研究内容十：酶处理对蛋白质微观结构的影响
为了进一步分析凝胶的微观结构，SEM观察结果如图5A-D所示。如图所示，未经处理的 EYG 表面具有大量不同尺寸的颗粒，没有表现出颗粒间粘附。由于脂肪酶对脂质颗粒的水解作用，LEYG的凝胶结构显得疏松而脆，促进了蛋黄蛋白的过度聚集。大聚集体的形成通常会阻碍蛋黄蛋白之间的交联，导致结构松散并降低硬度。相反，PEYG和FEYG表现出相似的致密凝胶状态，具有连续且结构良好的微结构。与EYG相比，PEYG和FEYG的微观结构显示出更松散的无序排列，表明蛋白质聚集减少可能归因于二硫键断裂。此外，酶水解导致与蛋白质分子相互作用的带电粒子增加，导致无序聚集，不利于形成致密的凝胶网络结构。
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图5 酶处理对EYG蛋白质微观结构(A)和氨基酸类型和含量(B)的影响研究内容十一：酶处理对游离氨基酸的影响
木瓜蛋白酶是一种肽链内切酶，对蛋白质或肽中涉及精氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸羧基的肽键表现出敏感性。对所得游离氨基酸的分析（图5E）揭示了木瓜蛋白酶水解后这三种氨基酸的水平增加，为酶处理下蛋白质结构展开提供了进一步的证据。风味蛋白酶是一种源自米曲霉发酵的混合酶，具有内肽酶和外肽酶活性。由于其丰富的酶水解位点，该酶可以将内肽酶产生的疏水性氨基酸肽链切割成单个疏水性氨基酸。丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸属于脂肪族氨基酸家族。热图（图5E）表明脂肪酶水解后脂肪族氨基酸含量增加，因为脂肪酶特异性作用于甘油三酯中存在的酯键，导致其降解为二甘油或非甘油甘油脂肪酸。赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸含量较高的蛋白质可能会表现出更强的风味结合能力，因为它们参与更多的共价相互作用。该图表明，木瓜蛋白酶和脂肪酶的加入显着提高了这三种氨基酸的含量，可能导致与风味物质的结合增强。因此，酶解EYG的挥发性风味成分发生了显着变化，导致其整体风味特征发生相应变化。这些发现与GC-MS分析和电子鼻测试获得的结果一致。
研究内容十二：PLSDA和相关性分析
使用PLSDA分析对四个样品的挥发性风味物质和质地（硬度、弹性、胶粘性和内聚性）进行分析。结果如图6A所示，从图中可以清楚地看出，C1和C2的综合贡献率达到65.7%，可靠性很高。值得注意的是，四个样本之间明显没有任何重叠，表明它们之间存在显着差异。此外，每组内可以观察到最小的变化，每个样本中三个点之间的微小差异就证明了这一点。这些发现表明，三种酶处理显着改变了EYG的风味和质地，这与GC-MS分析和质地评估一致。进行VIP分析以确定影响每个样品组风味和质地的关键参数（VIP值>1）。 根据图6B，肉桂醛表现出最高的VIP值，表明它对所有四种类型的凝胶的风味特征具有重大影响。这可能归因于肉桂醛独特的气味特性，肉桂醛可能在初级氧化阶段发生降解，从而影响整体风味感知。此外，内聚性成为影响所有四种凝胶质地特征的关键因素。食物的粘结性反映了咀嚼过程中其抵抗力和紧密连接受到破坏的程度，与物质的分子组成密切相关。酶处理引起蛋黄分子结构的显着改变，导致凝胶内聚性发生显着改变。此外，还进行了相关分析，以检查主要风味物质、质地和分子相互作用之间的关系。如图6C所示，分子相互作用、质地和挥发性风味成分之间存在相关性。三种酶处理增强了蛋黄表面的疏水性，有利于其在热处理过程中与风味物质的结合，从而增强了EYG的香气。此外，游离巯基对蛋黄质地的影响最大，并且与粘性和硬度呈负相关。这归因于低蛋白质凝胶化促进了巯基暴露。
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图6 PLSDA分析（A）、Vip评分图（B）和相关性分析（CDEFG）
酶处理显著改变了蛋黄蛋白质的二级结构，导致蛋白质打开并增加柔韧性。这种增强的柔韧性通过疏水相互作用、静电相互作用和氢键促进了重排。因此，挥发性风味物质更容易与蛋白质结合，从而改变了 EYG 的风味和质地。此外，木瓜蛋白酶、脂肪酶和风味蛋白酶表现出不同的酶水解位点:导致产生具有不同结构的蛋黄水解物。这些水解产物可以与不同风味物质结合，产生具有不同风味和质地的酶解 EYG,与 PLADS 分析结果一致。相关分析表明，酶处理主要影响游离巯基，导致热凝胶基质内二硫键含量的降低。因此，这种还原导致其硬度降低。此外，酶处理通过暴露更多的疏水基团来修饰蛋黄分子的二级和三级结构，这些疏水基团与风味化合物进行疏水相互作用，从而增强EYG的风味。
撰稿：莫 凡
校稿：曹少攀
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