Metal-Free Carbon
Nanozyme as Nicotinamide Adenine Dinucleotide Oxidase Mimic over a Broad pH
Range for Coenzyme Regeneration
DOI：10.1021/acs.chemmater.2c03138 杂志：Chemistry of
materials文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.chemmater.2c03138
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶能有效地催化NADH氧化为其氧化形式NAD+。NADH氧化酶(NOX)除了维持体内的ROS水平和NADH/NAD+的比值外，还可以在不需要额外底物的情况下很好地实现辅酶NAD+的再生。值得注意的是，NOX介导的方法可以提供辅酶来驱动依赖NAD+的生物合成，这在热力学和产物分离方面更可取(方案1)。在这种情况下，昂贵的辅酶的使用将显著减少。然而，天然氮氧化物存在成本高、稳定性差、回收困难等缺点，而微生物产生的副产物过氧化氢会严重影响串联脱氢酶的活性，因此，探索模拟水生成氮氧化物的人工材料具有重要意义。纳米酶具有制备简单、稳定性高、性能多样等优点，在生物传感、抗菌应用、疾病诊断等领域得到了越来越广泛的应用。到目前为止，许多纳米材料已经在通用底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)的作用下表现出类氧化酶活性。相比之下，用于特定生物分子氧化的纳米酶的研究仍然落后。对于氮氧化物的模拟，只有少数金属基纳米材料可以实现这一目标，包括贵金属纳米颗粒和铁或钴掺杂的纳米材料。已有研究报道了具有NOX性质的铂基复合PtNPs@MWCNTs，但当pH超过7.0时，其活性急剧下降。最近，也有一研究开发了一种钴基催化剂Co/C，比活性(SA)高达1.2U/mg，揭示了由NADH脱氢和电子从底物向O2转移组成的两步催化过程。然而，这些纳米酶仍然面临着两个挑战：(1)与天然氮氧化物类似，在pH=5.0-7.5时获得最佳性能，也不能满足大多数脱氢酶在碱性介质中(pH=7.5-10.5)的要求；(2)目前还没有已鉴定的无金属纳米酶来模拟NOX，它通常对恶劣条件表现出很强的耐受性和良好的生物相容性。氮掺杂碳纳米材料(NC)除了是氧气还原反应(ORR)的无金属电催化剂外，还是一类重要的氧化还原酶模拟物。![]()
图1 天然NOX和拟NOX纳米酶驱动的NAD+再生酶合成示意图。
探索针对特定生物分子的高性能纳米酶对于实际应用是至关重要的，但也是具有挑战性的。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶可以驱动氧化辅酶NAD+的高效再生，这对许多依赖NAD+的生物催化途径具有重要意义。然而，包括其不稳定性和与串联酶在pH、温度等方面的不兼容性等问题仍有待解决。本文报道了以g-C3N4为模板的具有类NOX行为的氮掺杂碳材料。模型s-NC纳米酶在较宽的pH值范围内表现出良好的催化活性，比活性高达3.2U/mg，明显优于已报道的模拟物。此外，将s-NC与天然脱氢酶偶联，建立了用于生物合成的纳米酶-酶杂交模型。值得注意的是，它可以很好地满足脱氢酶在碱性介质中的pH要求。该工作不仅开发了模拟氮氧化物的无金属纳米酶，而且对利用人工纳米酶进行NAD+介导的生物合成具有启发意义。
以双氰胺和葡萄糖混合物为原料，通过高温热解合成了不同的N掺杂碳材料(图1)，并通过不同的前处理方法得到了不同的热解前驱体，包括均匀处理的s-NC和直接物理研磨的g1-NC(图2A和1)。令人惊讶的是，前处理方法对相应纳米材料的催化性能有深刻的影响，其中只有s-NC表现出良好的类NOX活性。为了揭示处理方法的影响，首先研究了不同前驱体在600℃直接热缩合产生的中间体的结构。从X射线衍射图(图2C)中观察到，整齐的g-C3N4样品在(100)面内堆积的三-s-三氮杂环和(002)层间堆积的(002)面内堆积的衍射峰分别在12.9°和27.8°处显示出清晰的衍射峰。显然，s-NC-600的类似模式暗示了g-C3N4结构的保留，这种轻微的移动可以归因于葡萄糖在片层间的引入。同时，从X射线光电子能谱来看，s-NC-600的高原子N/C比也证实了g-C3N4结构的部分形成(图3)。此外，从高分辨C 1s谱(图2B)可以将s-NC-600在288.1 eV的结合能峰归属于g-C3N4的N-C=N中的碳原子，这是g1-NC-600所没有的。相比之下，研磨条件下只有一个明显的衍射峰出现在石墨碳的(002)面上，XPS谱中很大一部分外来的sp2碳物种(结合能为284.8 eV)也证实了石墨化过程。总体而言，s-NC的生产过程包括通过DCDA的热缩合形成g-C3N4模板(图2A)。据报道，g-C3N4具有较高的N/C比和在高温(>710℃)下易分解的特点，被认为是制备富N多孔材料的极好的自牺牲模板和氮源。为了考察g-C3N4的结构对催化活性的影响，通过两步法制备了g2-NC，即在600℃下以整齐的DCDA为原料合成多孔g-C3N4，然后g-C3N4与葡萄糖通过物理共混的方式进行混合。令人鼓舞的是，g2-NC也显示出良好的NOX样活性，这意味着g-C3N4模板在此类纳米酶的设计中起着关键作用。
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图2 (A)s-NC合成示意图；(B)s-NC-600和g1-NC-600的C 1s高分辨XPS谱；(C)不同前处理方法和(D)s-NC得到的gC3N4的XRD图；(E)s-NC的TEM图像；(E)s-NC和(F)g1-NC的拉曼光谱。
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图3 (A)s-NC-600和(B)g1-NC-600的XPS全光谱。
用X射线衍射仪、X射线光电子能谱、透射电子显微镜和高分辨电子显微镜对所制备材料的组成和结构进行了研究。三种纳米材料的X射线衍射谱在25.2和43.5°出现不同的宽峰，证明形成了非晶态石墨化区域(图2D和图4)，这也从HRTEM图像(图5)中观察到的不清楚的晶格条纹结构中得到了证明。同时，根据元素图显示了N在纳米材料中的均匀分布(图6)，s-NC的N原子百分比为1介于g1-NC和g2-NC之间。此外，从TEM图像中可以观察到，与具有多层结构的g1-NC相比，s-NC似乎更透明，具有连续的皱折结构(图2E)，可能是原子力显微镜图像所得出的厚度减小的结果。此外，s-NC和g1-NC的拉曼光谱峰分别属于无序的sp3碳(D带)、石墨化的sp2碳(G带)和二阶2D带。而s-NC较高的ID/IG值意味着更多的本征碳缺陷，这有利于电荷/质量转移效率(图2F)。总体而言，这样的褶皱形态、更高的N含量和更多的缺陷将为O2的吸附和还原提供更多的活性中心。![]()
图4 XRD图谱，(A)s-NC；(B)g1-NC；(C)g2-NC。
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图5 不同放大倍数的HRTEM图谱，s-NC（上）；g1-NC（下）。
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通过一般显色底物，包括TMB、ABTS和1，2-二氨基苯(OPD)在无光条件下的氧化，初步评估了类氧化酶的活性(图7)。s-NC对甲基溴有明显的催化活性，但对ABTS的氧化没有影响。因此，经典的辣根过氧化物酶(HRP)-ABTS比色传感被用来研究在催化过程中是否产生了过氧化氢。NADH的340 nm特征峰的减少证明了S-NC的类NOX活性(图8A)，这是NAD+所没有的。与纯NADH相比，只有在O2存在的情况下，催化体系在340 nm处有明显的减小(图8B)，这表明s-NC能够很好地驱动NADH的有氧氧化反应。为了确定NADH确实被氧化成NAD+，而不是生物活性不高的NAD+-二聚体，NADH的氧化过程与依赖于NAD+的ADH催化的乙醇氧化相耦合。NADH首先在30分钟内被耗尽，随后随着乙醇和ADH的加入，在340 nm处重新出现吸光度特征，表明产生了具有生物活性的NAD+(图8C)。吸收强度略低于初始值，这可归因于在ADH存在下NAD+/NADH水平的稳态平衡。此外，g2-NC的活性与s-NC相当，明显优于g1-NC(图8D-8E)。优异的催化性能源于它能够从O2中产生更多的ROS(图8F)。为了验证这一合成策略的普适性，当用其他有机分子取代葡萄糖作为碳源时，以g-C3N4为模板的纳米材料也具有显著的类NOX活性，热解温度对催化活性影响不大，这可能是由于主要的活性N物种吡啶和石墨N和更多的本征碳缺陷。总体而言，这种g-C3N4模板策略可能成为设计模拟NOX纳米酶的通用工具。![]()
图7 s-NC在不同底物上的仿酶行为。
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图8 s-NC的类NOX活性示意图。(A)NADH和NADH+s-NC混合物反应30分钟后的紫外吸收光谱；(B)s-NC介导的NADH氧化和随后添加ADH/EtoH用于NADH再生时，340 nm处的吸光度随时间的变化；(C)不同纳米材料的活性比较；(D)吸光度随时间的变化；(E)以二氯荧光素为荧光染料，在488 nm处的荧光强度反映ROS水平
在此基础上，系统研究了s-NC的类NOX性质，包括底物、O2还原产物、比活性和稳定性。除NADH外，其类似物BNAH可作为电子供体，有利于实际应用。同时，纳米酶不仅可以促进电子从NADH转移到O2，还可以转移到H2O2，O2可能是更好的电子受体。根据O2还原的副产物，NADH氧化酶可分为H2O2生成和O2生成两类。然而，在催化反应中检测到没有产生过氧化氢。考虑到电化学方法得出的近似四电子转移路径(图9)，s-NC纳米酶可能是一个生成水的氮氧化物模拟物。为了定量表征氮氧化物的活性，进行了表观稳态动力学分析。拟合的Michaelis−Menten曲线显示出米氏常数Km为0.31 mm，最大反应速度Vmax为1.22μM/S(图3A)。因此，SA值可达3.2U/mg，明显优于已报道的纳米酶，包括Co/C(1.2U/mg)、Co-MoS2(0.63U/mg)和PtNPs@MWCNTs(0.23U/mg)(图8B)。此外，已报道的天然氮氧化物和纳米酶在pH值为5.0-7.5的范围内表现出较高的活性，这不能满足依赖NAD+的脱氢酶生物合成的要求，因为大多数脱氢酶的最适pH值在7.5-10.5之间。令人兴奋的是，s-NC纳米酶在pH为5.0-10.0的范围内保持了高活性(图8D-8E)，与在不同pH条件下产生类似量的ROS(图8F)一致。同时，s-NC能够在多个循环中连续催化NADH氧化(图8C)。此外，与以葡萄糖氧化酶为模型的天然酶不同，s-NC纳米酶表现出优异的稳定性(图10-12)，如对强酸性/碱性介质的高度耐受性，优越的6个月内不衰减的储存稳定性，以及良好的批次稳定性和活性几乎不受重金属离子和低剂量有机溶剂的影响。这些特性将赋予s-NC纳米酶广泛的应用前景。![]()
图9 (A)s-NC在不同转速下的LSV曲线；(B)s-NC在1600rpm时氧还原的RRDE测量。
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图10 上排：(A)pH<5.0时NADH的吸光度；(B)pH>10.0时s-NC催化体系的吸光度随时间的变化；下排：有机溶剂DMF(A)和甲醇(B)的影响。
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图11 上排：s-NC在0.1M盐酸(A)和0.1M氢氧化钠(B)溶液中分别浸泡1h、2 h、3 h、4 h和5 h；下排：重金属离子(A)和纳米材料批次(B)对催化活性的影响；储存稳定性(C)。
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图12：上排：不同浓度强配体(EDTA和SCN-)对催化活性的影响；下排：pH(A)、重金属离子(B)、SCN(C和D)对天然GOX催化活性的影响。
为了深入了解其催化机理，进行了中毒实验和光学捕获实验。对大多数金属离子引入强配体(EDTA或SCN-)对活性影响很小，这可以排除金属物种的存在，并支持无金属的碳纳米酶(图12上排)。同时，确定了O2还原的活性中间体(图13)，其中NaN3和TH分别作为O21和·OH的清除剂。随着清除剂的加入，几乎可以忽略不计的影响揭示了这两种类型的ROS并没有产生。此外，选择氢乙锭(HE)作为·O2−的荧光探针，观察到明显的增强信号，表明·O2−自由基的形成。此外，ζ电位的变化反映了纳米酶与底物之间的平衡吸附和解吸过程。因此，考虑到纳米材料对ORR的催化机理(图14)。首先，NADH分子通过π−π堆积作用连接到纳米酶表面，吡啶N可以作为路易斯碱位与NADH的酸性氢质子结合。NADH给电子给s-NC，然后给O2，·O2−中间体可以继续接受电子和H+形成H2O。最后，平衡的吸附和解吸过程保证了高性能的催化反应。
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图13 (A)ζ电位在催化过程中的变化(A)；(B)自由基清除剂NaN3和TH对NADH氧化的影响；以HE为·O2-探针在不同pH(C-D)下的荧光强度。
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图14 s-NC纳米酶好氧氧化NADH的可能机制。
除O2外，基于Fe(III)的物种还可以作为电子受体，包括铁氰化物、氯化血红素和半胱氨酸蛋白Cytc；因此，s-NC具有类似于Cytc还原酶的性质(图15A)。以氯化血红素为模型，在340 nm处的明显下降意味着s-NC介导了NADH到氯化血红素的电子转移(图15B)，这为细胞色素C的研究奠定了坚实的基础。仅NADH并没有产生明显的变化；但是，随着s-NC的引入，α带(550 nm)的出现和Soret带向413 nm的轻微移动揭示了铁向亚铁形式的转变(图15C)。同时，伴随着340 nm处NADH消耗的减少，证实了NADH向Cytc的电子转移。因此，s-NC可以作为Cytc还原酶，这一点得到了特征吸光度随时间或NADH浓度的变化的进一步支持(图15D)。众所周知，细胞色素C还原酶作为线粒体中的呼吸复合体III，是改变细胞外电子传递途径的重要蛋白质。上述结果将赋予s-NC另一种生物学功能，有望成为人工代谢中细胞色素C还原酶的替代者。![]()
图15 (A)s-NC模拟Cytc的示意图；氯化血红素(B)和Cytc(C)为电子受体的UV-Vis光谱；(D)NADH的340 nm和Cytc的550 nm的随时间变化的吸收。
NAD+的一个主要功能是作为脱氢酶辅酶。我们选择了各种依赖NAD+的亮氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶与s-NC偶联进行串联酶促合成(图16A)。令人鼓舞的是，生产的NAD+表现出与商业案例相似的动态趋势，略有差异可能是由于不完全离心产生的微量s-NC纳米酶抑制了NADH的再生(图16B)。此外，基于LeuDH的体系表现出明显低于其他两种体系的再生效率，因为它的热力学平衡倾向于还原反应的方向，这可以通过酶的定向进化来解决。此外，碱性条件下的反应速度远高于中性或酸性条件下的反应速度，具有较佳的NAD+/NADH比(图16C)。因此，在最适pH为9.0的条件下，所设计的纳米酶能很好地满足酶反应的要求。此外，随着纳米酶/酶比例的变化，NADH的表观吸光度显著变化(图16D)。当纳米酶的SA与脱氢酶的SA相同时，吸光度趋于零，表明s-NC介导的NADH氧化和天然酶驱动的NAD+还原之间达到了平衡。总体而言，这种高效的回收系统可能会为生物催化应用创造机会。![]()
图16 (A)s-NC与亮氨酸脱氢酶串联酶促合成示意图；(B)各种脱氢酶驱动的NADH生产，商品NAD+的虚线；(C)pH依赖的吸收变化；(D)以及不同s-NC/亮氨酸脱氢酶比值下的吸光度随时间的变化。
综上所述，本文报道了第一个无金属碳纳米酶具有H2O形成NOX样活性的案例。s-NC纳米酶在pH为5.0-10.0的宽pH范围内表现出良好的NOX催化活性，打破了天然或已报道的纳米酶pH<7.5的限制。同时，其比活力可达3.2U/mg，是已报道的类NOX纳米酶中最高的。此外，将s-NC纳米酶与脱氢酶偶联，建立了适用于碱性条件下酶合成的纳米酶-酶杂交模型。本工作不仅提供了一种在较宽的pH范围内具有模拟氮氧化物行为的高效碳纳米酶，而且为人工纳米酶介导的NAD+生物合成开辟了一条新的途径。
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