Chitosan-based multifunctional films reinforced with cerium oxide
nanoparticles for food packaging applications
DOI：10.1016/j.foodhyd.2023.108910文章链接：https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2023.108910
随着人类生活方式的快速变化，世界各地对即食、加工和包装食品的需求不断增加。这种不断变化的消费者行为正在将食品科学的研究范式转向包装技术。因此，当务之急是找到保存食物的方法，并将其保质期延长到尽可能长的时间。随着全球包装食品文化的增加，塑料的使用急剧增加，特别是在过去的几十年里。塑料是用于食品包装的最经济的高性能材料，重量轻，易于加工，高度可塑，透明。然而，一次性塑料的大量使用导致了塑料基城市固体废物(MSW)处理的全球性问题。最近，在寻找防止食物变质和变质的方法方面进行了大量的研究。在食品中使用化学防腐剂是最常用的策略。然而，消费者对这些防腐剂的长期副作用的认识日益提高，这增加了寻找食品保存替代方法的需求。
食品和材料研究人员目前正在研究的可能解决方案是在食品包装中使用生物聚合物。有几项研究已经为此目的探索了天然聚合物。壳聚糖是食品包装应用中最丰富和研究最多的生物聚合物之一。它是自然界中仅次于纤维素的第二普遍的碳水化合物聚合物。壳聚糖是甲壳素的去乙酰化衍生物，从甲壳类动物的外壳和真菌细胞壁中获得。它无毒，可生物降解，并拥有美国食品和药物管理局(US-FDA)公认的安全(GRAS)地位。壳聚糖具有优异的成膜性能，是目前唯一的抗菌生物聚合物，这为食品包装保鲜和延长保质期提供了一个值得探索的优势。另一种越来越受欢迎的保存包装食品的方法是活性食品包装。活性包装处理功能食品包装的制造和应用，保护食品变质并延长其保质期(Mahmud等人，2022)。食品腐败的最常见原因已被确定为微生物污染和氧化降解(Roy et al, 2021)。在活性包装材料中添加抗菌和抗氧化成分有助于保护食品免受这些变质因素的影响。然而，在包装配方中添加这些功能成分中的每一种都增加了总体材料成本，在批量生产过程中可能会增加大量的材料成本。因此，不断需要寻找更便宜的多功能成分，当添加到食品包装中作为填料时，可以服务于多种用途。
在这方面，金属氧化物纳米颗粒是赋予食品包装生物聚合物功能同时改善其物理化学特性的最常见和广泛使用的材料(Priyadarshi, Roy,
etal, 2021)。在各种金属氧化物纳米颗粒中，氧化铈纳米颗粒(Nanoceria)由于其特殊的性能(包括自由基清除性能和抗菌活性)而引起了重大的研究推力，使其可能是唯一具有抗氧化作用的纳米材料。铈是一种稀土金属，属于镧系元素系列，目前用于多种工业应用，如燃料电池、催化和微电子。铈具有Ce (III)和Ce (IV)两种氧化还原态，形成Ce2O3和CeO2两种类型的氧化铈(ceria)。纳米二氧化铈由于其较大的表面体积比而具有氧缺陷，有助于清除自由基。纳米子膜，单独使用或与其他生物材料联合使用，已被用于修复/再生各种组织，如皮肤、骨骼、心脏和神经(Purohit et al, 2022)。然而，目前还没有关于纳米陶瓷作为功能性成分在食品包装中的应用的报道。
因此，本研究旨在利用纳米二氧化铈作为壳聚糖基膜的多功能填料，并研究它们对这种抗菌生物聚合物性能的潜在协同效应。以食品包装为研究对象，研究了纳米复合薄膜的理化性质和功能特性。
本研究首次探讨了纳米二氧化铈作为多功能填料在食品包装生物聚合物薄膜中的应用。采用共沉淀法合成纳米二氧化铈。制备了含有1wt %和2wt %纳米二氧化铈的壳聚糖基食品包装膜，并对其进行了表征。FTIR吸收光谱证实了壳聚糖与纳米粒结构之间存在氢键。纳米复合膜除了具有机械强度、热稳定性和高阻湿性能外，还具有较强的UV-A和UV-B阻隔性能。此外，由于铈在Ce3+和Ce4+之间的氧化态转换，纳米铈表现出很高的光催化活性。结果对大肠杆菌和单核增生乳杆菌具有很强的抗菌活性，特别是在可见光下。此外，纳米复合膜对ABTS和DPPH自由基的清除能力分别比原始壳聚糖膜高1.25倍和2.3倍，表明其具有较高的抗氧化潜力。此外，该薄膜对L929细胞具有良好的生物相容性，表明其与食品接触应用是安全的。由于这些特性，添加了纳米二氧化铈的壳聚糖薄膜在活性食品包装方面显示出巨大的潜力，特别是在坚果和肉类等高脂肪食品包装方面。利用扫描电子显微镜(SEM)和能谱仪(DLS)对合成的纳米陶瓷进行了尺寸和形貌表征。纳米陶瓷的SEM图像(图1a)显示存在部分球形的团聚颗粒。此外，DLS分析如图1b所示，显示了纳米陶瓷的平均尺寸为266.9 nm。这种增大的尺寸分布可以解释为DLS无法区分有机和无机材料，它计算聚集的纳米颗粒的水动力直径(Purohit et al, 2020)。发现纳米粒子的Zeta电位为-28.3±6.10 mV。较高的表面电荷会在纳米颗粒之间产生排斥力，从而阻碍团聚。因此，可以说合成的纳米颗粒是稳定的。不同研究人员也获得了纳米陶瓷的类似结果。为了证实纳米二氧化铈的合成，对粉末样品进行了XRD分析。图2a为纳米陶瓷的XRD谱图，与JCPDS卡号34-0394一致。在2θ = 29.5◦，33.6◦，47.1◦和56.9◦处，用各自的指数(111)，(200)，(220)和(311)表示了不同的x射线衍射峰。这种模式对应于纳米陶瓷的面心立方(FCC)萤石结构(Li et al, 2018;南达,2016)。![]()
图1 (a) SEM图像，(b) DLS尺寸分布，(c)合成的氧化铈纳米颗粒Zeta电位。
研究内容二：薄膜的形态和结构表征
图2b比较了原始壳聚糖膜和添加CeNPs膜的FT-IR光谱。壳聚糖膜光谱中的特征带分别位于3430、1086和1030 cm-1，分别是由于-OH基团、3 ' -OH基团和5 ' -OH基团的拉伸振动引起的(Priyadarshi & Negi, 2017)。1632 cm-1处的条带对应于C=O拉伸振动，1556 cm-1处的条带对应于壳聚糖结构中- NH2基团的剪切振动(Priyadarshi & Negi, 2017)。此外，1400 cm-1和1380 cm-1附近的吸收带分别对应于酰胺C-N拉伸和不对称CH2振动。纳米复合膜的光谱表现出类似的波段模式，除了波长在550和850 cm-1之间的大吸收带，对应于O-Ce-O基团振动是导致这种宽吸收带的原因(Purohit et al, 2020)。此外，在1383 cm-1处观察到CeNPs掺入时带强度下降，这表明CeNPs与壳聚糖链中与CH2基团相连的OH相互作用。此外，在1559 cm-1的吸收带中观察到轻微的位移，这表明在CeNPs和壳聚糖之间形成了氢键。原始壳聚糖的XRD谱图证实了生物聚合物的无定形性质，没有明显的衍射峰。壳聚糖的唯一特征峰出现在2θ = 20◦附近，这与前人的研究一致(Kumar & Koh, 2012)。随着CeNPs的加入，纳米复合膜的XRD光谱中也出现了纳米陶瓷FCC结构对应的特征峰(Nanda, 2016)。这描述了纳米微球在壳聚糖基质中的成功结合。
图3所示的SEM图像进一步证实了纳米陶瓷的掺入。整齐的壳聚糖薄膜表面光滑，无变形和气孔，表明壳聚糖成膜性能良好。随着纳米填料的加入，薄膜的粗糙度比原始薄膜有所增加。在壳聚糖/CeNP1%薄膜中，纳米铈在壳聚糖基体中均匀分布。然而，随着浓度的进一步增加，从壳聚糖/ CeNP2%薄膜的SEM图像中可以看出，纳米微球开始聚集。然而，纳米粒子的聚集性不是很高，大部分粒子仍然分散在壳聚糖基质中。然而，这种聚集似乎足以影响纳米复合薄膜的性能。在纳米颗粒中，特别是金属氧化物纳米颗粒中，通常报道过这种高浓度的纳米颗粒聚集(Riahi etal, 2021)。![]()
图2 (a)观看了CeNP、Chitosan和Chitosan/CeNP纳米合成电影(b) FTIR spectra基于纳米合成胶片的片段。
![]()
图3 (a)壳聚糖，(b)壳聚糖/CeNP1%，(c)壳聚糖/CeNP2%薄膜的SEM图像。
通过分别测量亮度、红绿标度、黄蓝标度对应的Hunter L、a、b值来估计膜的颜色特性，结果如表1所示。整齐的壳聚糖薄膜呈黄色，其阳性b值为46.3，呈黄色。黄度指数值为81.3，色相角为84.8◦，进一步证实了黄膜的颜色。值得注意的是，90°左右的色相角度代表黄色。加入CeNPs后，膜的颜色值和亮度没有明显变化。然而，黄度指数显著下降了至少7.5%，表明黄色色调有所下降。这是由于CeNPs的淡黄色减少了电影中的黄色色调。色相角度也证实了这一点，色相角度也略有下降，但明显下降。有趣的是，这种差异只出现在纯纳米复合膜和加入了CeNPs的纳米复合膜之间，纳米复合膜的黄度指数和色相角没有显著变化。
壳聚糖基薄膜的透射光谱如图4a所示。原始壳聚糖薄膜在可见光区透光率最高，600 nm以上透光率>80%。根据600 nm波长辐射的透射率确定了透明度，估计在83%左右，证实了原始膜的高透明度。另一方面，与原始壳聚糖膜相比，纳米复合膜在可见光区的透射率相对较低，表明其透明度相对较低。透明度的降低可归因于金属氧化物纳米颗粒反射入射在其上的光的能力。其他研究人员也讨论了类似的现象。尽管如此，壳聚糖/CeNP1%和壳聚糖/CeNP1%薄膜在>600 nm光谱区的透射率仍在60%以上，T660值分别为62%和64%。尽管添加了CeNPs降低了透明度，但从光学图像中观察到，纳米复合膜仍然是相当透明的(图4c)。有趣的是，如图4a所示，所有壳聚糖基薄膜都表现出良好的紫外线阻挡能力(即> 400 nm)。
对壳聚糖基膜的UV-A和UV-B阻隔效果也进行了估计，结果如图4b所示。原始壳聚糖本身显示出巨大的阻挡紫外线辐射的潜力，结果表明，几乎100%阻挡UV- b和~97%阻挡UV- a辐射。此外，添加CeNP填料增强了壳聚糖膜的这一性能，壳聚糖/CeNP2%膜的UV-A阻隔率提高到98.5%。食品包装薄膜的防紫外线性能非常重要，因为紫外线辐射会导致某些食品氧化，特别是坚果和肉制品等高脂含量食品(Priyadarshi, Kim，& Rhim, 2021)。此外，有报道称，观察到紫外线介导的蔬菜(如土豆)变绿，从而使其质量恶化并产生致癌物质。此外，紫外线辐射会导致某些红肉的颜色褪色，从而降低消费者对它们的接受度。![]()
图4 (a)壳聚糖基膜在200 nm - 800 nm范围内的透射光谱，(b)壳聚糖基膜对UV-A和UV-B的阻隔性能，(c)壳聚糖基膜的透明数字代表图像。
为了确定壳聚糖基薄膜的力学性能，分别通过测量拉伸强度(TS)、弹性模量(EM)和断裂伸长率(EB)来确定强度、刚度和柔韧性，结果如图5所示。整齐壳聚糖膜的抗拉强度为~56 MPa，与之前报道的值一致(Roy & Rhim, 2021)。随着纳米线的掺入，拉伸强度值呈浓度依赖性增加。添加1 wt%和2 wt%纳米铈后，膜的强度分别提高了近15%和28%。早些时候也观察到，加入金属氧化物纳米颗粒后，壳聚糖基薄膜的抗拉强度也有类似的增加，并且归因于聚合物基质中纳米颗粒的应变诱导排列导致更好的负载分配能力。壳聚糖基薄膜的拉伸断裂值随着纳米微球的加入而减小，这与报道的结果一致。拉伸强度的增加通常对薄膜的柔韧性有相反的影响。然而，尽管有持续的浓度依赖性降低，但在添加2 wt%纳米铈时，观察到壳聚糖膜的EB值有统计学意义的降低，导致EB值降低34%。此外，随着纳米颗粒的增强，EM值也有所增加，表明纳米复合膜的刚度更高。这也符合普遍观察到的趋势，即EM值与添加纳米填料后的TS值直接相关(Shankar & Rhim, 2018)。然而，EM值在纳米微球掺入时没有显著变化，表明刚度只有轻微增加。![]()
图5 壳聚糖基薄膜的力学性能(a)抗拉强度，(b)断裂伸长率，(c)弹性模量。柱和误差条分别表示平均值和标准差。柱状图中不同字母表示差异有统计学意义(p < 0.05)。
添加纳米粒后，壳聚糖基膜的水蒸气阻隔性能随浓度的增加而增加，如图6所示。原始壳聚糖膜的WVP为1.44 × 10.9 g m/m2 . pa。这与报道的脱乙酰度≥75%的壳聚糖薄膜的结果一致(Shankar & Rhim, 2018)。随着CeNP浓度的增加，膜的WVP有统计学意义的降低。数值下降到1.12 × 10-9 g m/m2 . pa和1.09 × 10-9g m/m2 . pa。壳聚糖/CeNP1%膜和壳聚糖/CeNP2%膜的制备方法该值的下降是由于壳聚糖基体结构在加入CeNPs后扭曲度增加，使得水分子的通过更加复杂。然而，纳米复合膜之间的差异没有统计学意义，这表明即使在1wt %的浓度下，壳聚糖羟基也被CeNPs饱和。![]()
图6 (a)壳聚糖基薄膜的水蒸气渗透性和(b)水接触角特性。*P < 0.05为差异有统计学意义。柱和误差条分别表示平均值和标准差。
另一方面，WCA值在加入CeNPs后没有明显变化。原始壳聚糖膜的WCA为61.2◦，与其他研究人员先前报道的值一致。而纳米复合膜的WCA值分别为62.4◦和63.1◦，略有不显著的增加。结果表明，加入CeNP对膜表面结构无明显影响。从纳米复合膜的FTIR光谱可以看出，壳聚糖的疏水性略有提高的原因可能是CeNPs只与单体上的一个OH基团(即与CH2基团相连的一个OH)相互作用。在氮气气氛下对壳聚糖和纳米铈掺杂膜进行热降解，结果如图7所示。所得的热图是光滑的，并分两个步骤描绘了质量损失。第一个质量损失步骤约100◦C对应的蒸发表面水分或氢键水与残留的乙酸。在144.2℃、151.9℃和147.8℃时，原始壳聚糖、壳聚糖/CeNP1%和壳聚糖/CeNP2%的质量损失分别为5%。这表明纳米陶瓷掺入膜可能含有更多的结合水。热分解的第二阶段(170-420°C)是由于壳聚糖的降解，这是由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖环之间的糖苷键的断裂引起的。在壳聚糖薄膜基体中添加1%纳米二氧化铈对壳聚糖薄膜的热稳定性没有明显影响。然而，含有2%纳米铈的壳聚糖膜的热稳定性显著降低。这可以解释为较低浓度的纳米微球对聚合物微观结构的影响，因为从SEM图像中可以看出，纳米微球在整个聚合物基体中均匀分布。然而，在较高的浓度下，纳米粒倾向于聚集。这可能导致与聚合物基体的相互作用减少，从而降低热稳定性。![]()
图7 壳聚糖基薄膜的热性能:评价添加CeNP对壳聚糖基薄膜热稳定性的影响。
单核增生李斯特菌和大肠杆菌分别是常见的食源性革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物。因此，对制备的纳米复合膜对这两种模式生物的抗菌效果进行了测试。在暗、光两种条件下测试了纳米二氧化铈掺杂壳聚糖膜的抗菌活性，探讨了纳米二氧化铈光催化性质对壳聚糖膜抗菌性能的影响。在黑暗条件下(图8a和b)，干净的壳聚糖膜显示出对大肠杆菌的抑菌作用，而在12小时后观察到对单核增生乳杆菌的100%杀菌活性。在壳聚糖膜中掺入纳米粒后，观察到对两种试验菌株的抑菌活性均呈浓度依赖性。纳米粒掺入增强了抗菌活性。在纳米粒浓度为1wt %的条件下，12 h后大肠杆菌细胞全部被杀灭，3h内单核增生乳杆菌细胞被完全根除。当纳米粒浓度增加到2 wt%时，两种菌株的细胞活力在3 h内降至零，显示出较强的抗菌作用。
另一方面，在光照条件下(图8c和d)，所有薄膜的抗菌效果都更明显。有趣的是，整齐的壳聚糖薄膜在光照条件下比在黑暗条件下更有效。这是第一次获得这样的结果，将在这方面进行进一步的调查。此外，纳米二氧化铈负载膜也显示出增强的抗菌效果。添加1 wt%和2 wt%纳米铈的膜分别在6 h和3 h内根除了所有活的大肠杆菌细胞。然而，两种薄膜在暴露3小时内都能100%根除单核细胞增生乳杆菌，具有显著的抗菌潜力。
纯壳聚糖的抗菌活性归因于质子化胺基团的存在，这被各种研究人员广泛报道。纳米粒的抗菌活性也得到了广泛的研究，并归因于细菌细胞与纳米粒之间的相互作用导致氧化还原过程。该过程由细菌细胞膜上带负电荷的部分(如脂质)和纳米粒之间的静电相互作用开始，其中铈以正氧化态存在。一旦这种相互作用发生，纳米微粒子就会通过接受细菌表面带负电荷基团的电子而减少，从而干扰细胞膜的正常代谢过程，最终导致细胞膜破坏，导致细菌细胞死亡(Farias et al, 2018)。众所周知，铈在Ce4+和Ce3+氧化态之间转换。这种氧化还原现象是这种纳米粒子的特点，使其在生物系统中具有很高的功能。![]()
图8 壳聚糖基薄膜在黑暗(a和b)和光照(c和d)条件下对大肠杆菌和单核增生乳杆菌菌株的抑菌活性测试。误差条表示标准差。
壳聚糖基膜的抗氧化活性通过测定其清除ABTS和DPPH自由基的潜力来估计，结果如图9所示。整齐的壳聚糖膜也显示出一定的自由基清除潜力，对ABTS和DPPH的清除能力分别为33%和14%，这是根据先前的研究结果得出的(Roy & Rhim, 2021)。壳聚糖的这种清除机制与自由基可以与残留的游离氨基(NH2)反应形成稳定的大分子自由基有关。另一方面，纳米复合膜具有较高的DPPH和ABTS自由基清除能力，显示出浓度依赖性的抗氧化活性增加。纳米铈含量为2 wt%的纳米复合膜对ABTS和DPPH自由基的清除率分别为75%和50%。
纳米铈的这种自由基清除特性源于其在CeO2和Ce2O3状态之间切换的能力(即在Ce3+和Ce4+氧化态之间切换)，这是由于其晶体结构中存在氧空位而发生的(Purohit et al, 2022)。![]()
图9 壳聚糖基膜在ABTS和DPPH自由基清除能力方面的抗氧化活性。
纳米粒清除氧化自由基的催化机制类似于超氧化物歧化酶(SOD)的作用，后者是天然存在的超氧化物阴离子清除剂(O2-)。
通过MTT法测定暴露第1天、第3天和第5天L929细胞线粒体活性，评估壳聚糖和纳米粒壳聚糖膜存在下的细胞活力。所有膜样品和TCP的MTT分析结果如图10所示，显示线粒体活性随时间增加。此外，与TCP和壳聚糖膜相比，含有膜样品的纳米陶瓷显示出略高的线粒体活性。此外，FDA/EtBr染色结果显示，所有膜样品中都有更多的活细胞(绿色)。因此，可以这样说，所有壳聚糖和含有壳聚糖膜的纳米粒都是无细胞毒性和生物相容性的。所得结果与前人关于CeNP的研究一致。壳聚糖膜对CeNP生物相容性的增强可能与CeNP清除自由基的能力有关。壳聚糖与CeNP具有协同作用，可降低氧化应激;这有助于提高生物相容性。含CeNP的壳聚糖食品包装膜与食用物质保持接触，微/纳米物质可能转移。在这方面，生物相容性评价提供了有关包装材料细胞毒性的见解。![]()
图10 (a) MTT法测定壳聚糖基膜对L929小鼠成纤维细胞线粒体活性的影响;(b) L929细胞暴露5天后的活死染色图像。*P < 0.05为差异有统计学意义。柱和误差条分别表示平均值和标准差。
在本研究中，制备了不同浓度(即1 wt%和2 wt%)的氧化铈纳米颗粒掺入壳聚糖基薄膜。对壳聚糖薄膜的形貌和结构进行了表征，发现壳聚糖薄膜中纳米微球分布均匀，聚集现象可以忽略不计，特别是在低浓度时。红外光谱进一步证实了壳聚糖和纳米粒链之间存在氢键。研究了原始膜和纳米复合膜的物理化学和功能特性以及生物相容性，并对其潜在的食品包装应用进行了研究。在纳米粒的掺入下，最初透明、淡黄色的壳聚糖膜在外观上没有太大的变化。然而，透明度有所下降。然而，所有的薄膜都有效地阻挡了UV-A和UV-B辐射。此外，纳米填料的加入显著增强了壳聚糖基膜的水蒸气阻隔性，使壳聚糖/CeNP2%膜的WVP值降低了近25%。此外，由于添加的纳米铈在Ce3+和Ce4+氧化态之间切换，表现出较强的光催化作用。纳米复合膜对常见食源性致病菌大肠杆菌和单核增生乳杆菌具有较高的抑菌活性，且在可见光下抑菌活性显著增强。此外，通过对纳米复合膜清除氧化自由基的潜力的估计，也证实了纳米复合膜具有良好的抗氧化活性。壳聚糖/CeNP2%膜对ABTS和DPPH自由基的清除能力分别比原始膜高125%和235%。最后，所有壳聚糖基薄膜都表现出对L929细胞的生物相容性，表明它们在食品接触应用中是安全的。制备的纳米陶瓷壳聚糖薄膜具有高抗氧化、抗菌和紫外线阻隔性能，以及高生物相容性，是潜在食品包装应用的有力候选材料。这些新型纳米复合膜在实际食品包装方面的应用还有待进一步的研究。
撰稿：张昭歌
校稿：曹少攀
![]()
