锌指结构域插入激活特定DNA位点上的重组酶

Activation of recombinases at specific DNA loci by zinc-finger domain insertions

研究背景

研究摘要

研究内容

为测试DNA结合域的融合是否能改善Cre型工程重组酶的性能，将ZFD融合到这些酶的N端或C端。选择EGR1转录因子Zif268的ZFD和Cre衍生的重组酶Brec1，这些蛋白已被很好表征。先前研究表明，所设计的融合蛋白中的不同参数都会影响融合蛋白的活性。创建融合文库，其中链接器长度在Brec1和Zif268之间由不同数量的柔性GGS重复序列(2-12)变化（图1a）。此外，研究人员创建了一个lox-zif靶位库，其中Brec1识别位点（loxBTR, 34个碱基对(bp)）与9-bp的Zif268结合基序之间的间距从0 bp到10 bp不等。纳入相对于loxBTR半位点的两种不同方向的Zif268结合序列（图1b）。为测试所有276种可能组合，研究者在大肠杆菌pEVO质粒的靶位点文库上表达了设计的融合复合物，计算重组质粒与非重组质粒的比例，使用纳米孔测序来量化重组效率（图1c）。

结果显示，连接子长度、靶位点间距和方向的最佳组合显示出更高的重组率。对于N端和C端文库的活性改善最大的是12×GGS重复的连接子，以及loxBTR和zif结合基序之间的间隔长度为5bp（图1d）。在低重组酶表达水平的质粒基础上测试最佳组合显示，平均重组效率为85%（C端Brec1-Zif268在loxBTR-5-zif (a)位点融合），而WT-Brec1在相同条件下平均重组质粒为7%（图1e-g）。

图1 N端和C端Brec1-Zif268熔接的优化。a.融合文库的描述。b.目标站点库概述。c.纳米孔测序的质粒重组筛选示意图 d.根据N端和C端Brec1-Zif268融合体的纳米孔测序结果推断的热图。e.质粒重组实验示意图。f.在低诱导水平（1µg ml−1 L -阿拉伯糖）下，对指定的重组酶变体和靶位点进行代表性质粒活性测定。g.对指示变异和靶位点的重组率进行量化。

研究内容二：Cre型重组酶的五肽扫描诱变

另一种产生ZF -重组酶融合的可能方法是将ZFD序列插入到重组酶的编码序列中。然而，这种插入融合可能使酶失去功能。为确定工程重组酶中可以耐受小插入的位置，使用四种不同的重组酶，即Cre，Brec1，D7L和D7R，进行五肽扫描诱变。利用体外Mu转位，研究人员创建了四个文库，在重组酶的整个阅读框中引入5个氨基酸的框内插入，并选择保留重组酶活性的变体，进行长读测序。读取图谱显示，Cre中的插入在许多位置都是耐受的，反映了该酶对插入诱变的稳健性（图2a）。而Cre衍生的重组酶未表现出相同模式，允许插入五种氨基酸的区域更少。Cre、Brec1、D7L和D7R的活性突变体在蛋白质的相同区域含有插入，表明这些区域是潜在的通用插入位点（图2b）。基于这些残基与DNA的频率、空间可达性和接近性，选择残基278和279之间的位置进行进一步分析。

研究人员使用高通量筛选来开发带有ZFD的插入融合的架构。使用两个连接体将Zif268融合在Brec1的残基278和279之间，每个连接体由1-8个GGS重复组成（图2c），创建一个文库，将该文库与先前开发的目标位点文库一起表达。使用纳米孔测序技术对得到的1472种组合进行测试，发现所有携带插入的Zif268融合的变异在wt loxBTR上都无活性（图2d）。观察到对较长的连接物，5-bp间距和目标位点取向B的强烈偏好。在基于质粒的实验中测试Zif268与8×GGS连接体融合的最佳变体，以下称为Brec1²⁷⁸-Zif268。与筛选结果一致，Brec1²⁷⁸-Zif268融合在wtloxBTR上的活性受损，但在loxBTR-5-zif (B)位点上恢复了完全活性（图2e,f）。因此，插入的ZFD融合产生了一个重组酶，该重组酶依赖于ZFD与目标序列的结合来实现重组活性。

为研究ZF -重组酶在人细胞中的融合功能，将Brec1或Brec1²⁷⁸-Zif268表达构建体与荧光重组报告质粒一起瞬时共转染HEK293T细胞（图2g）。Brec1不区分loxBTR和loxBTR-5-zif靶位点，并以60%左右的速度重组了这两个报告质粒。Brec1²⁷⁸-Zif268在HEK293T细胞中的活性在wt loxBTR质粒上严重受损，而在loxBTR-5-zif上观察到几乎完全的重组活性(B)（图2h）。之后进行进行了五肽扫描诱变筛选，并测试了Zif268与Vika的融合，Vika是一种从溶珊瑚弧菌分离的重组酶，以及三种进化的基于Vika的重组酶。研究人员能够重复用Cre型酶获得的结果，证明了该方法的可移植性。

图2 插入的ZFD融合产生ZF依赖的重组酶系统。a.五肽扫描诱变筛选结果。b.Brec1（红色）、D7L（绿色）、D7R（深蓝色）和Cre（浅蓝色）的累积插入频率。c.插入融合文库的描述。d.根据插入的Brec1-Zif268融合体的纳米孔测序结果推断的热图。e.在高诱导水平（200µg ml−1L -阿拉伯糖）下，对指定的重组酶变体和靶位点进行代表性质粒活性测定。f.从波段强度量化重组率。g.用于HEK293T细胞重组实验的质粒结构示意图。h.转染HEK293T细胞48小时后，用流式细胞术对指示变异的重组效率进行定量分析。

为在天然人类基因组位点上测试开发的方法，选择将其应用于异二聚体Cre衍生的重组酶D7，该重组酶最近被开发用于纠正导致血友病A的140 kb基因组int1h倒置。研究人员设计了ZFL1和ZFL2用于F8基因loxF8靶点上游的人类基因组序列，ZFR1-4用于下游序列。利用公开可用的平台测试了278号位置的单体（D7L和D7R）与设计的对称位点（loxF8L和loxF8R）上的ZFD融合的活性，以及其扩展版本。与之前的结果一致，测试的配合物都没有对loxF8L和loxF8R显示活性。D7L-ZFL1和D7R - ZFR4融合酶在扩展的靶位点上显示出活性。改善对于所设计的ZFD，采用了底物链接定向进化(SLiDE)协议来进行ZFD的定向进化。创建随机突变的ZFL1和ZFR4文库，并将这些文库克隆到一个修饰的进化载体中，其中包含重组酶序列和各自的靶位点（图3a）。研究人员进行了20个突变、选择和反选择循环，以改善ZFD与侧翼位点的特异性结合，并观察到最终文库在扩展目标位点上的重组活性大幅增加（图3b）。

图3 底物连接的锌指结构域定向演化。a.锌指结构域的底物连接定向分子进化示意图(ZF-SLiDE)。b.通过质粒重组法评估ZF-SLiDE进展。

研究将两个单体文库结合起来，并对最终扩展的loxF8靶位点上与ZFD融合的重组酶异二聚体的活性进行多轮选择。选择克隆G10（以下简称D7-ZF）进一步研究（图4a,b）。序列分析显示，在定向进化过程中，ZFL和ZFR分别获得了5个和12个突变，以及连接子上的4个和3个突变，包括其右侧连接子上的两个保守的G-to-R变化。

为进一步研究D7-ZF可能的改善作用，使用由D7异源二聚体8重组的人类基因组脱靶HG2和HG2L上进行测试。D7- ZF在这些非靶标或其扩展版本上无活性（图4c）。研究人员在loxF8-flank-L和loxF8-flank-R靶点上测试了异源二聚体。仅存在一个ZFD结合位点就能显著降低D7-ZF的重组活性，但并未完全消除它。为测试D7- ZF是否可能由于存在额外的DNA结合结构域而在新的脱靶上获得活性，从人类基因组中筛选了具有可能被进化的ZFD从脱靶位点的一侧或两侧识别的侧翼序列的lox位点。在8个已确定的潜在人类脱靶(HGZF1-8)上测试了D7和D7-ZF。D7重组了这些脱靶中的两个（HGZF4和HGZF5），而D7- ZF在任何位点上均未检测到重组活性，表明其具有高特异性（图4d）。之后进行基于测序(ChIP-seq)的分析。用这种方法找到了25个高置信度的D7-ZF推测结合位点。选择前10个命中点，用高灵敏度的质粒测定法在大肠杆菌中进行验证和重组活性测试。D7-ZF在这些位点上没有表现出任何重组活性。继续探索140kb片段潜在的意外缺失，并在重组酶方法和Cas9核酸酶之间进行比较分析。PCR分析显示，在Cas9核酸酶处理的细胞中存在表明大量缺失的片段。相反，在用D7或D7-ZF处理的样品中，未观察到特定于缺失的条带。

图4 D7-ZF的表征 a.D7-ZF突变分析。b.D7-ZF对loxF8和loxF8侧翼的代表性质粒活性测定，包括在人类基因组中发现的ZFD结合靶位的侧翼基因组序列。c. D7- ZF对预测的人类基因组loxf8样脱靶的代表性质粒活性测定，这些脱靶由D7及其扩展版本重组，包括lox位点的上游和下游的侧翼基因组序列。d.D7和D7- ZF对D7- ZF可能识别序列的预测人类基因组loxf8样脱靶的代表性质粒活性测定。e.F8基因的一个片段的示意图。f.用D7或D7- ZF转染HEK293T细胞72 h后，检测F8基因loxF8位点的PCR琼脂糖凝胶图像。g.D7和D7- ZF转染HEK293T细胞72 h后loxF8基因座的转化效率，用qPCR方法定量。

深入探索通过引入插入性ZFD来驯服松弛特异性Cre衍生重组酶的可能性。研究人员选择了RecFlex，这是一种从先前的进化活动中鉴定出的重组酶，它显示出宽松的靶点特异性。RecFlex能够重组一系列lox样位点，包括loxFlex1、loxFlex2、loxFlex3、loxFlex4和loxFlex5，每半位点相差6到9 bp（图5a）。这些目标位点之间的序列相似性只有31-54%，这表明RecFlex具有重组数千个不同目标序列的潜力。通过对人类基因组中loxFlex基序发生的广泛全基因组调查，成功确定位于人类X染色体上MECP2位点(loxMECP2)内的临床相关的Recflex样靶点。

为研究RecFlex的特异性是否可以通过与Zif268插入融合而重定向，研究人员生成了RecFlex²⁷⁸-Zif268融合蛋白，并评估了其在带有和不带有zif基序的五个loxFlex位点上的活性（图5b）。RecFlex²⁷⁸-Zif268融合破坏了所有五个lox位点的活性，而在这些位点两侧存在zif基序时，重组活性得以恢复（范围从37%到62%；图5c）。RecFlex²⁷⁸ - Zif268也破坏了loxMECP2靶标上的活性，只有在loxMECP2侧翼存在zif基序时，loxMECP2靶标上的活性才得以恢复。与野生型RecFlex相比，RecFlex²⁷⁸-Zif268在所有lox-zif靶点上的活性都增加了，这表明该酶不仅依赖于ZF与侧翼zif268基元的结合，而且该酶的总体活性也增强了，可能是由于ZFD提供的DNA亲和力增加。

图5 通过ZFD融合可以定制RecFlex的靶点特异性。a. RecFlex重组酶重组的靶位点比对。b.用于活性测定的目标位点的描述。c. RecFlex和RecFlex278-Zif268的代表性质粒活性测定。

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