Enhancing Enzyme Activity Using Hydrophilic Hollow Layered
Double Hydroxides as Encapsulation Carriers
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.3c05237
研究背景
目前，涉及化学合成和生物技术的工业过程正在向生态友好和具有成本效益的路线过渡，以实现地球的可持续未来。酶具有独特的选择性、高催化效率、温和的反应条件和可生物降解性，是实现绿色生物制造的“关键”，可以实现社会效益和生态效益。不幸的是，酶固有的脆弱性(在恶劣的实际条件下)和不可恢复性极大地限制了它们的实际应用。酶固定化是一种基于吸附、共价结合和交联的酶在固体载体上的空间限制，是克服酶固有缺点的有效方法，大大促进了生物技术的产业化。然而，并不是所有的载体和固定策略都能在酶的情况下提供最佳优势。在这一领域仍然存在重大挑战，如酶泄漏，酶结构的不可逆破坏，酶活性位点的可及性差。天然生物矿化激发的原位酶包封策略可以在温和条件下同时进行酶固定化和载体合成，有效克服了传统后固定化策略的上述缺点。此外，原位包封适应于保留酶的性质，克服酶的大小限制，并解决了在恶劣环境下酶敏感性受损的问题。
研究摘要
研究内容
研究内容一：ZnCo-LDH@ DNA@GOX&HRP的制备与表征
LDHs一般不适合酶包封，因为合成LDHs的反应条件，如高温、强碱、尿素水解等，容易使天然酶失活。因此，我们提出了一种自我牺牲的模板法，在温和的条件下合成中空的LDHs，以实现酶的无损包封。选择室温下可在水溶液中合成的ZIF-L (Zn)作为预包封双酶的牺牲载体。随后，引入过渡金属钴，并用酸性金属盐蚀刻ZIF-L，形成具有优异电性能的中空ZnCo-LDH，作为被封装酶的护甲。考虑到ZnCo-LDH的制备是关键步骤，我们在酶包封前系统优化了合成条件。包封酶的构建过程如方案1所示。选择葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)作为级联酶反应的模型酶。生物分子中氨基酸残基的负电荷对加速ZIF-L的形成至关重要，ZIF-L在生物分子周围具有高负载效率。在接近生理条件下，带有大量负电荷的ssDNA与酶组装在一起，以增加负电荷，从而促进更多的酶包封。然后，将酶-ssDNA偶联物与Zn(NO3)2和2-HmIM在室温下一锅反应混合，得到自我牺牲模板(ZIF-L@DNA@GOX&HRP)。空心LDH的形成可归因于同时蚀刻和共沉淀过程。当Co(NO3)2加入时，ZIF-L@DNA@GOX&HRP的表面被Co2+离子水解产生的质子蚀刻。ZIF-L中锌与2-HmIM之间的Zn - N配位随后被破坏，从而使Zn2+离子缓慢释放。此外，蚀刻过程中产生的质子促进了NO3−的氧化能力，使得标准还原电位较低的Co2+离子被部分氧化为Co3+，OH−离子随着质子的消耗而积累。此时，Co2+/Co3+、Zn2+和OH-离子在ZIF-L@DNA@GOX&HRP表面共沉淀形成LDHs (ZnCo-LDH)。蚀刻后反应呈壳状结构，透射电镜观察。TEM图像证实固体ZIF-L(图1E)和ZIF-L@DNA@GOX&HRP(图1G)在5 mg mL−1的Co(NO3)2溶液中转化为空心的壳状LDHs(图1F，H)。
通过X射线衍射(XRD)证实了所制备样品的晶体结构(图2A)。ZIF-L@DNA@GOX&HRP的特征衍射峰与ZIF-L的特征衍射峰吻合较好，说明酶包封没有改变晶体结构。酸蚀处理后，ZIF-L的衍射峰完全消失，表明ZIF-L发生了崩解。而在ZnCo-LDH和ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP的2θ值分别为9.6°、19.3°、33.1°和59.0°处，可以观察到(003)、(006)、(012)和(110)晶面对应的新峰。这一结果与报道的LDH典型结构一致，证实了ZIF-L成功转化为LDH。此外，利用X射线光电子能谱(XPS)研究了ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP的化学组成和元素结合状态(图2B−D)。如图2B所示，在ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP的全光谱中可以看到Zn 2p、Co 2p、O 1s、N 1s、C 1s、S 2p和P 2p的主峰。蛋白- ssDNA特异的P和S元素的存在证明酶包封成功;N元素的存在归因于酶的引入或插入NO3−离子进入LDH。在Co 2p核能级光谱(图2C)中，四个拟合峰分别为780.73、781.79、786.62和797.71 eV，分别属于Co3+2p3/2、Co2+ 2p3/2、Co3+2p1/2和Co2+ 2p1/2，以及一对卫星峰(命名为Sat.)，分别为786.9和802.9 eV。在Zn 2p光谱中(图2D)，结合能分别为1021.8和1044.9 eV的拟合峰归属于Zn 2p3/2和Zn 2p1/2，表明Zn (II)的存在。
进一步验证双酶是否成功封装，傅里叶变换红外(FTIR)光谱和zeta电位测试(图3A,B)。酶固定后，蛋白的酰胺I带(C = O拉伸振动)出现在约1640 ~ 1660 cm−1处。1050和846 cm-1处的峰为层间NO3−证实了XPS的结果。zeta电位测量表明，通过磺基SMCC偶联到ssDNA的GOX和HRP表现出更强的负电荷(图3B)，这加速了酶通过生物矿化的包封过程。与纯ZIF-L(−6.11 mV)和ZnCo-LDH (+10.1 mV)相比，ZIF-L@DNA@GOX&HRP和ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP表面的电荷分别降低到−8.85和+7.51 mV，表明酶固定化成功。最后，为了确定酶在包封体系中的分布，我们分别用罗丹明B (RhB)和异硫氰酸荧光素(FITC)荧光染料标记GOX和HRP，并通过共聚焦激光显微镜(CLSM)对合成的ZIF-L@DNA@GOX&HRP和ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP进行了表征。如图3C,D所示，RhB−GOX和FITC−HRP的红色和绿色荧光分别均匀分布在材料(ZIF-L和ZnCo-LDH)中，表明酶的内部包封。
研究内容二：ssDNA对双酶包封的影响
图4 (A) 基于ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP的葡萄糖比色检测示意图。(B)不同体系中的酶活性。(C)有或没有引入ssDNA的ZIF-L和ZnCo-LDH包封体系中酶的含量。
研究内容三：载体和酶结构对酶活性的影响
进一步量化和比较天然和ZnCo-LDH、ZIF-L、ZIF-67和COF-LZU1的催化性能。进一步量化和比较天然和ZnCo-LDH、ZIF-L、ZIF-67和COF-LZU1的催化性能。以ABTS为显色底物，测定包封酶或游离酶与不同葡萄糖浓度反应后上清的吸光度。根据反应速率和底物浓度(GLU)之间的关系得到Michaelis - Menten方程，用于评估不同双酶体系中GOX的动力学性质(图6C)。为了全面评价不同双酶体系的催化活性，我们用紫外-可见分光光度计监测了ZnCo-LDH、ZIF-L、ZIF-67和COF-LZU1包封酶体系和酶含量相同的天然酶体系催化的时间依赖性产物的生成过程(图6D)。与COF-LZU1@DNA@GOX&HRP、ZIF-L@DNA@GOX&HRP和ZIF-67@DNA@GOX&HRP相比，ZnCo-LDH@ DNA@GOX&HRP的UV - Vis吸光度显著增加，但与游离酶相比，其吸光度降低了30%。特别是，Zn-Co-LDH@DNA@GOX&HRP在最初的150秒内表现出与游离酶几乎相同的酶活性和反应速率，随后反应速率的降低产生了活性差异。最终表观酶活性的降低可能是因为与游离酶相比，将快速积累的产物转移到ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP的外部溶液的进一步过程。总之，动力学研究证实了ZnCo-LDH@ DNA@GOX&HRP具有优异的催化活性，这与中空ZnCo-LDH所提供的适宜的酶促环境和高底物亲和力是分不开的。
图6 为载体和酶结构对酶活性的影响: (A) ATR - FTIR光谱(1800 ~ 750 cm−1，蓝色虚线框为酰胺I和酰胺II波段)和(B) 对应的二阶导数ATR - FTIR光谱。(C) Lineweaver - Burk曲线。(D)酶活性转化。
研究内容四：稳定性和可回收性增强
通常，高温会导致酶的空间结构发生变化，导致活性降低甚至失活。因此，我们研究了包封酶和游离酶在50℃下的热稳定性(图7A)。ZnCo-LDH@DNA@ GOX&HRP在热处理100 min后，保留了70%以上的活性，而GOX&HRP在热处理100 min后，生物活性迅速下降到40%。结果表明，所制备的固定化酶具有较好的热稳定性。由于色氨酸的荧光发射光谱对环境很敏感，因此它可以用来指示残基是埋藏在酶内还是暴露于外部环境，从而表征酶结构的变化。考虑到HRP的荧光光谱微弱到可以忽略不计，我们以GOX为参考，研究了ZnCo-LDH@ DNA@GOX&HRP和游离GOX&HRP在335 nm处的荧光信号，以确定酶在恶劣条件下的三级结构变化(图7B)。38、59在50℃加热100 min后，游离GOX&HRP的λmax红移至341 nm，而ZnCo-LDH@DNA@ GOX&HRP没有红移。此外，酶的结构易受有机溶剂的影响。在不同的有机溶剂中处理90min后，包封酶的催化活性远高于游离酶(图7C)。在相应的荧光光谱中(图7D)， ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP产生的发射线与未处理的GOX产生的发射线几乎相同。相反，不同有机溶剂处理的游GOX和HRP的λmax表现为10 nm的蓝移和3 nm的红移。在实际应用中，良好的存储稳定性也是必不可少的。在4℃保存45天后，研究游离酶和包封酶溶液的酶活性和荧光光谱(图7E,F)。ZnCo-LDH@DNA@ GOx&HRP表现出接近100%的初始活性和不变的三级结构。相比之下，游离酶的生物活性降低了20%，光谱发生了3.6 nm的红移。为了评估包封酶的实用性，测试了可重用性。如图7 G所示，ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP在10个循环后仍保持约85%的生物活性。综上所述，中空Zn-Co-LDH在恶劣环境下可以有效保护酶免受破坏(图7H)，在实际应用中可以节约成本，提高酶的利用效率。
图7 (A) ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP和游离GOX&HRP在50℃下加热不同时间后的活性。(B) ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP和游离GOX&HRP在50℃下加热100 min后的荧光光谱。(C) ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP和游离GOX&HRP在有机溶剂中暴露90 min后的相对活性和(D)荧光光谱。(E) ZnCo-LDH@DNA@GOX&HRP和游离GOX&HRP在4℃下保存45 D后的相对活性和(F)荧光光谱。(G) ZnCo-LDH@DNA@GOx&HRP的可重用性。在10 mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中测量所有荧光光谱(激发波长:275 nm)。(H) LDH护甲酶保护和性能增强示意图。
撰稿：杜影妍
校稿：曹少攀
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