Bacterial Surface-Assembled Chitinosome for
Dismantling Chitin into N-Acetyl Glucosamine
DOI：10.1021/acssuschemeng.3c02296杂志：ACS SUSTAINABLE CHEMISTRY & ENGINEERINGhttps://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssuschemeng.3c02296
将级联酶募集并组织到可以进行顺序生化转化的多酶机器中已成为现代生物制造的研究重点。这些多酶机器通常用于从简单的构建单元合成复杂分子。为了拥抱和推动向可持续生物经济的过渡，开发多酶机器以有效分解顽固聚合物同样重要。甲壳素是一种可再生且难处理的多糖，由β-1,4糖苷键中的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）残基组成，是最丰富的天然聚合物之一。在过去的十年中，开发酶介导的可持续生物工艺以增加几丁质生物质的价值化趋势。例如，提出了一种由几丁质酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶组成的双酶级联反应，通过分批将几丁质完全分解成GlcNAc或一锅工艺。由分离株Paenibacillus
sp.生产的几丁质分解混合物。LS1用于将结晶几丁质分解为 N-乙酰氨基葡萄糖。此外，生物膜介导的多酶系统用于直接从几丁质生产氨基葡萄糖。由于广泛的分子间氢键，几丁质不溶于水和其他常见溶剂。它通常经过化学修饰以形成胶体几丁质或预处理，更容易被水解。然而，反应（酶和微尺度几丁质多糖之间）仍然受到传质限制，导致催化活性低和高价值化学品的收率低。因此，需要一种更有效的几丁质生物降解策略。
事实上，这种策略是由细菌通过数百万年的进化而发展和优化的。为了分解和利用不溶性木质纤维素生物质，厌氧纤维素分解细菌产生一种称为纤维素体的精细多酶纳米机器。纤维素体通过特定的粘连蛋白-多克林相互作用整合各种纤维素酶和半纤维素酶，并且可以在通过碳水化合物结合模块降解之前牢固地附着在不溶性纤维素上。过去的努力表明，纤维素体比游离纤维素分解酶的混合物表现出更高的活性，表明纤维素体中的酶协同作用以拆除顽固的多糖底物。例如，Moraïs等人制造了一种含有纤维素酶/木聚糖酶的混合设计纤维素体，其对小麦秸秆的活性增强（∼2.4倍）。Davidi等人将漆酶整合到设计纤维素体中，并观察到小麦秸秆还原糖的产量增加了2倍。值得注意的是，Eibinger等人最近用快速延时原子力显微镜观察了单个纤维素对微晶纤维素的解构，并得出结论，纤维素在纤维素上局部结合了几分钟甚至更长时间。相比之下，自由扩散酶在纤维素上的停留时间仅为几十秒。由于纤维素体积大，与纤维素结合增强，停留时间延长，被认为是催化协同作用的重要因素。Lu等人证明，当梭状芽孢杆菌热细胞纤维素体呈现在细胞表面时，比没有细胞-酶附着时更有效地水解纤维素，这表明三元纤维素-多酶-微生物复合物的形成对于催化协同作用也是必不可少的。受纤维素分解微生物的酶-微生物协同作用的启发，我们制备了一种大肠杆菌表面组装 （ESA） 酶级联反应，该级联反应由几丁质水解酶 BpChiA（来自副地衣芽孢杆菌的几丁质酶，登录号。CP033198.1） 和 BlNagZ（来自地衣芽孢杆菌的 β-N-乙酰氨基葡萄糖酶 ）。鉴于结构相似性，我们将共定位的酶复合物称为合成几丁质体，其中BpChiA 主要负责将几丁质水解成 N，N′-二乙酰壳二糖 （（GlcNAc）2），BlNagZ 用于转换 （GlcNAc）2变成N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）。这些酶分别表达，并通过SpyCatcher-SpyTag （SpyC-SpyT） 偶联在大肠杆菌细胞表面共组装。可以优化细胞表面重复的SpyC单元的数量以及SpyT与酶之间的长度，以最大限度地提高酶的上样效率和活性。几丁质体中不同几丁质水解酶的比例也是可调的。与分别组装在细胞表面的两种几丁质水解酶的混合物和自由扩散的 SpyTag-酶的混合物相比，共定位的双酶系统表现出加速的 GlcNAc 释放。我们将这种增强归因于两个因素，即级联水解酶的共定位和三元几丁质-多酶-微生物复合物的形成。这项工作表明，通过将酶整合到设计几丁质体中，可以安装和增强不同几丁质水解酶之间的催化协同作用，为从顽固生物质生物制造高价值产品铺平了道路。
构建一种高效的多酶催化剂，用于将顽固性聚合物分解成高附加值化学品，这在可持续生物制造中很有吸引力。级联酶的共定位已被天然和合成多酶系统广泛采用用于化学合成，而对聚合物底物分解的研究很少。在这项研究中，我们构建了一个大肠杆菌表面组装（ESA）系统，通过 SpyCatcher/SpyTag （SpyC/SpyT） 偶联共定位由两种几丁质水解酶 BpChiA 和 BlNagZ 组成的合成几丁质体。在ESA-几丁质体复合物中，通过分别调整SpyC的拷贝和SpyT与酶之间的连接子长度，提高了酶的加载效率和比活性。BpChiA和BlNagZ的配比也得到了优化。ESA-几丁质体复合物表现出比细胞表面单独组装的酶混合物更高的N-乙酰氨基葡萄糖的生产力。这项工作表明，酶的共定位和三元ESA-几丁质体-几丁质复合物的形成对于级联酶的催化协同作用至关重要，为顽固性聚合物底物的分解提供了新的见解。研究内容一：ESA系统的构建
将遗传元件和相应的蛋白质编码DNA模块融合到单个表达盒中。LSP，脂蛋白信号肽。OmpA，大肠杆菌的外膜蛋白A。SpyC/SpyT，SpyCatcher/SpyTag的缩写。HA-tag，一种与 FITC 抗 HA 抗体特异性结合的 YPYDVPDYA 序列。TP，靶蛋白。在ESA系统中，通过E77（绿色）催化的K31（黄色）和D117（橙色）之间形成异肽键，SpyC显示在能够与SpyT标记的靶蛋白结合的细胞表面。所有向量信息都显示在表S1中。通过PyMOL软件可视化蛋白质结构。![]()
由热细胞梭菌进化出的三元纤维素-多酶-微生物复合物被认为是纤维素水解的主要媒介。受三元复合物结构的启发，我们首先构建了一个ESA系统，用于在大肠杆菌表面组装几丁质降解酶。如图 1 所示，我们采用脂蛋白信号肽 （LSP）-外膜蛋白 A （OmpA）融合系统作为载体，将 SpyC 蛋白呈递到大肠杆菌 BL21 （DE3）细胞表面。将与 FITC 抗 HA 抗体特异性结合的血凝素标签（HA-tag） 融合到 SpyC 的 C 末端进行免疫荧光标记。单独表达的靶蛋白（TPS或酶）携带 SpyT 部分可以自发地与锚定在细胞膜上的 SpyC 结构域形成分子内异肽键。与通过将 TP 基因融合到载体上直接在细胞表面显示 TP 相比，单独制备 ESA 系统和 SpyT 标记的蛋白质以进行后续组装，在构建和修饰多酶-微生物复合物方面提供了更大的灵活性。
为了检查SpyC/SpyT系统与细胞包膜的整合，构建了质粒pET28a-LSP-OmpA-SpyC-HA并转化为大肠杆菌 BL21 （DE3） 以产生 ESA-1 菌株。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析显示，与LSP-OmpA-SpyC-HA的理论大小相对应的蛋白质条带约为28 kDa（图S2a）。通过FITC抗HA抗体标记诱导的ESA-1和荧光激活细胞分选（FACS）分析，ESA-1表面显示SpyC的最佳表达条件设置为在25°C下用0.5mM IPTG诱导15 h（图S2b，c）。在这种情况下，94%的ESA-1细胞用FITC抗HA抗体标记，而对照菌株（非诱导的ESA-1）几乎没有被相同的抗体标记（图2a）。为了通过 SpyC/SpyT 相互作用测试蛋白质组装在细胞表面的有效性，在大肠杆菌中表达 SpyT 融合的荧光蛋白 eGFP-SpyT 作为靶蛋白。E77Q突变体ESA-1E77Q型，用作阴性对照，其中催化残基Glu77在SpyC中突变为Gln以消除异肽键的形成。将重组蛋白eGFP-SpyT与诱导的ESA-1细胞混合，并通过FACS分析荧光细胞（图2b）。结果表明，97%的ESA-1细胞是用eGFP-SpyT组装的，而ESA-1E77Q型组装失败（图 2b）。在2.0至7.0的pH范围内，细胞表面的蛋白质组装效率高于80%（特别是在pH值为4.0至7.0时超过95%），但当pH值高于7.0时，蛋白质组装效率急剧下降（图2c）。在4°C下孵育过夜后，表面组装系统在2.0至9.0的宽pH值范围内表现出高pH稳定性（图2d）。
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图2 SpyC/SpyT 介导的大肠杆菌表面蛋白质组装（a） 对显示ESA-1单元效率的SpyC进行FACS分析。采用FITC抗HA抗体标记与SpyC相连的HA标签，采用非诱导ESA-1细胞作为阴性对照。（b） ESA-1细胞上eGFP-SpyT组装的FACS分析;欧空局-1E77Q型被用作阴性对照。（c） pH值对ESA-1细胞蛋白质组装效率的影响。组装使用不同的缓冲液：甘氨酸盐酸盐（0.1 M，pH 2-3）、柠檬酸钠2HPO公司4（0.1 M，pH 3-8）、Tris-HCl（0.1 M，pH 8-9）和甘氨酸钠（0.1 M，pH 9-10）。（d）用蛋白质组装的ESA-1细胞的pH稳定性。
研究内容二：SpyC对ESA系统的基因剂量影响
为了能够组装更多SpyT标记的蛋白质拷贝，我们随后设计了基因剂量来调整细胞表面显示的SpyC的量。使用HA标签与最后一个SpyC单元的C末端融合以进行免疫探测，即pET28a-LSP-OmpA-（SpyC）构建编码SpyC单元的多个串联重复序列n-HA，其中 n = 1、2、3 或 4（图 3a）。因此，将获得的菌株命名为ESA-n。诱导后，通过SDS-PAGE检测ESA-1、ESA-2、ESA-3和ESA-44株重组蛋白的表达。每种衍生的融合蛋白LSP-OmpA-（SpyC）n-HA迁移为深色和厚带，分子量分别为28、38、48和58 kDa（图S3a）。FACS分析显示，96%的ESA-2、92%的ESA-3和94%的ESA-4细胞可以用FITC抗HA抗体标记，显示出高多拷贝SpyC显示效率（图S3b）。通过在室温下与纯化的eGFP-SpyT孵育30分钟来检查ESA-n细胞的表面组装能力。SDS-PAGE分析显示，重组蛋白LSP-OmpA-（SpyC）n-HA可以有效地与n个eGFP-SpyT拷贝组装（图3b，箭头）。组装的eGFP-SpyTs的细胞荧光强度与细胞密度（荧光强度/OD600）几乎与ESA-1、ESA-2和ESA-3的SpyC拷贝数呈线性增长，而ESA-4则减少（图3c）。这可能归因于空间位阻限制了蛋白质锚定能力。
为了确定ESA-3细胞的蛋白质载量，诱导的ESA-3细胞（10mg，湿重）与1mL不同浓度（0.2至0.8mg / mL）的eGFP-SpyT溶液在30分钟内以旋转方式孵育。在不同时间点（5、10、20和30分钟）取上清液，以确定eGFP-SpyT的残留量。如图3d中的箭头所示，在所有条件下孵育20分钟后，上清液中eGFP-SpyT的残留量变化不大，表明此后蛋白质组装完成（图3d）。我们确实注意到，eGFP-SpyT的一小部分始终保持未组装状态，这种现象以前已经观察到，可能是由于构象变化造成的。(26,32)当与0.6 mg/mL eGFP-SpyT一起孵育时，组装体达到饱和，ESA-3细胞的平均eGFP-SpyT负载能力为每克ESA-3细胞53 mg蛋白质（湿重）（图3e）。
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图3 ESA系统的基因剂量优化。（a）将多个串联重复 SpyC 单元编码在单个表达盒中，用于在细胞表面组装更多拷贝的靶蛋白。（b）eGFP-SpyT在ESA-n细胞上组装的SDS-PAGE分析。泳道 M：蛋白质标志物;泳道 1、3、5 和 7：游离 ESA-1、ESA-2、ESA-3 和 ESA-4;泳道 2、4、6 和 8：用 eGFP-SpyT 组装的 ESA-1、ESA-2、ESA-3 和 ESA-4 电池。箭头表示 ESA-n 细胞组装 eGFP-SpyT 的不同形式。（c） 分析荧光强度与细胞密度的比值（荧光强度/OD600）的ESA-n细胞，用eGFP-SpyT组装。（d）在30分钟内用不同浓度的eGFP-SpyT组装ESA-3细胞后上清液中eGFP-SpyT残留量的SDS-PAGE分析。 （e）定量分析ESA-3孵育20分钟后上清液和沉淀物中的eGFP-SpyT量。误差线表示 SD ± （n = 3） 的平均值。
研究内容三：用于胶体几丁质分解的合成ESA-几丁质体复合物的构建多酶催化剂的催化效率很大程度上取决于其空间组织，而空间组织通常被精确控制以促进底物运输。利用 ESA-3 表面显示平台，我们制备了合成的 ESA-几丁质体复合物，其中几丁质体被定义为共定位在大肠杆菌细胞表面的 BpChiA 和 BlNagZ 复合物。BpChiA 能够将胶体几丁质的 β-1,4-糖苷键水解为（GlcNAc）2，然后通过 BlNagZ 将其转换为 GlcNAc（图 4a）。BlNagZ本身几乎不水解胶体几丁质。我们首先异源表达 BpChiA、BlNagZ 和 SpyT 标记酶BpChiA-L1-SpyT（缩写为AL1T） 和 BlNagZ-L1-SpyT（缩写为ZL1T），在大肠杆菌BL21（DE3）中（图S4）。ESA-3 for AL的表面组装能力1T 和 ZL1T是相同的，并确定为每克ESA-3细胞32.5mg蛋白质（图S5）。我们测量了AL的具体活性1T 和 ZL1T以游离和组装形式朝向其小分子底物p-NP-（GlcNAc）2和 p-NP-GlcNAc。两个组装的AL的活动1T 和 ZL1与自由扩散的基材相比，朝向这些基材的T略有下降（图4b）。然而，当使用胶体甲壳素作为底物时，AL1在ESA-3细胞上组装的T从1.19急剧下降到0.07U / mg（图4c）。由于胶体几丁质是一种大到数百纳米到几微米的大分子底物，空间位阻可能会阻碍几丁质进入AL的活性位点1T 显示在单元格上。(34)为了减轻空间效应，我们延长了 BpChiA 和 SpyT 之间的连接子长度，产生了 BpChiA-L2-SpyT（缩写为AL2T）和BpChiA-L3-SpyT（缩写为AL3T）（图4b）。延伸肽基接头不会影响酶表达（图S4）和酶组装到ESA-3细胞表面（图S5）。组装的SpyT标记的BpChiA的比活性随着肽基接头的变长而增加（AL为0.11 U/mg2T 和 0.16 U/mg 用于 AL3T）（图4c）。考虑到在体内融合蛋白生产过程中，未受保护且柔韧的长连接子区域通常容易受到蛋白水解切割的影响，(35)我们没有尝试更长的链接器，而是使用了 AL3T在以下研究中。![]()
图4 ESA-几丁质体复合物的构建和表征（a） 游离 BpChiA 和 BlNagZ 或合成的 ESA-几丁质复合体复合物催化几丁质向 GlcNAc 级联转化的示意图。（b） BpChiA、BlNagZ和SpyT标记衍生物（AL1T，AL2T，AL3T 和 ZL1T）以游离或组装形式朝向其相应的小分子底物。（c）上述游离或组装酶对大分子底物胶体几丁质的特异性活性。
研究内容四：促进ESA-几丁质体复合物产生GlcNAc
现在，我们已经设计了所有用于在细菌细胞表面组装合成几丁质体的构建块。然后，我们通过改变AL的比率来优化级联活性3T 为 ZL1T在恒定量的总酶下组装在ESA-3细胞表面。在50°C下用ESA（10mg）-几丁质体（150μg）复合物酶解1mL胶体几丁质（1%）3小时后，当AL的摩尔比为AL时，观察到GlcNAc的产率最高3T/ZL1T 等于 10（图 5a）。评价AL之间的催化协同作用3T 和 ZL1T，比较了ESA-几丁质酶体复合物与游离酶混合物的活性，如图S6所示。游离酶混合物释放更多（GlcNAc）2在初始阶段，因为游离AL的活性3T对几丁质的T远高于细胞表面组装的AL3T（图4c）。然而，3 h后其产生的GlcNAc少于ESA-几丁质体复合物，表明游离ZL的反应速率1T比组装的T小。这强烈表明（GlcNAc） 的局部富集2在几丁质-多酶-微生物的界面处，加速了ZL的反应速率1ESA-几丁质体复合物中的T。然后，我们比较了ESA-几丁质体复合物与ESA-AL混合物对GlcNAc的产生3T 和 ESA-ZL1T.如图5b和S7所示，ESA-AL的混合物3T 和 ESA-ZL1T 在 3 小时内释放 0.14 mg GlcNAc（14% 产率），而 ESA-几丁质体复合物其中 AL3T 和 ZL1共定位的T释放出0.23mg的GlcNAc（23%的产率），表明GlcNAc的产量增加了64%。ESA-几丁质体复合物水解6小时后，GlcNAc的产率进一步提高到34%，仍高于混合物（图S8）。这些结果表明，AL3T 和 ZL1T是几丁质酶降解中催化协同作用的来源。此外，合成的ESA-几丁质体复合物允许酶在多个循环中轻松重用。第一轮催化（50°C，3小时）后，通过以9000rpm离心1分钟回收复合物。弃去上清液后，将1 mL 1%胶体甲壳素施加到体系中，启动新一轮催化。如图S9所示，经过5轮催化剂回收后，相对GlcNAc产率保持在60%以上，证明了合成ESA-几丁质体复合物在工业应用中的潜力。我们假设三元几丁质-多酶-微生物复合物的形成对于催化协同作用也至关重要。我们分别用FITC抗HA抗体和罗丹明-B（RhoB）标记ESA-3细胞和底物胶体几丁质，并通过激光扫描共聚焦显微镜观察混合物（图5c）。在不加载酶的情况下，将ESA-3细胞和胶体几丁质颗粒随机分散。相比之下，在表面显示酶时，Pearson的相关性和Manders的共定位分析证实，很大一部分细胞-酶复合物与胶体几丁质共定位（图5c）。这可能归因于多价酶-底物结合亲和力提供的增强吸附。因此，一次 （GlcNAc）2由AL制作3T在几丁质和ESA-几丁质复合体复合物的界面处，会积累到更高的局部浓度（GlcNAc）2在密闭空间中，ZL1T 已准备好将其转换为 GlcNAc。该机制最近被用于解释由级联酶在微载体上的共定位导致的活性增强。在这项研究中，由于三元ESA-几丁质体-几丁质复合物比常规载体结合酶为中间底物提供了更好的限制，因此可以设想相当大的通道样效应。结合所有这些因素，我们观察到胶体几丁质向GlcNAc的转化有所改善。这些合成的ESA-几丁质复合物的构建受到纤维素-微生物复合物结构的启发，其构建单元，包括碳水化合物结合模块、纤维素体酶、微生物、粘连蛋白和多克林，已被广泛用于设计处理小分子底物的更高效的多酶催化剂。然而，天然纤维素体-微生物复合物的进化是为了分解大的、不溶性的聚合物底物，因此它们的设计原理应推广到纤维素以外的难处理聚合物的酶降解。例如，多种酶在细菌生物膜上的共固定化已应用于几丁质的生物转化和淀粉。在这项研究中，我们强调ESA-几丁质体复合物催化协同作用的关键成分包括酶共定位和三元ESA-几丁质体-几丁质复合物的形成。我们合成的ESA-几丁质体复合物与纤维素体-微生物复合物的结构和功能非常相似，显示出解构几丁质多糖的增强活性。本研究基于实验室前期解析的ADAE底物复合体晶体结构，对其结构信息进行进一步分析。通过分析ADAE结构底物结合口袋及催化活性中心，发现ADAE单体结构呈典型的(α/β)8
TIM桶状结构，该结构在KEase高度保守。在酶分子底物口袋内部，完全保守的四个催化残基（Glu144、Asp177、His203和Glu238）与Mg2+配位形成包含金属离子的催化活性位点。同时当底物D-果糖定位于催化活性中心时，D-果糖O1、O2、O3与Mg2+以及多个氨基酸残基（Glu144、Glu150、His180、His203、Arg209和Glu238）发生相互作用。上述结构特征在KEase家族酶中高度保守，说明ADAE催化D-果糖转D-阿洛酮糖具有相同C3-O3质子交换机制。![]()
图5 通过合成的ESA-几丁质复合物酶解胶体几丁质。（a）生产（GlcNAc）2和GlcNAc通过配备不同摩尔比AL的 ESA-几丁质体复合物3T 为 ZL1T. 欧空局-ZL1T 和 ESA-AL3T 代表专门用 ZL 组装的 ESA-3 电池1T 和 AL3T。（b） （GlcNAc）的时程生产2和 GlcNAc 通过 ESA-几丁质体复合物和 ESA-AL 的混合物3T 和 ESA-ZL1酶摩尔比为10：1。（c）三元ESA-几丁质体-几丁质复合物的激光共聚焦显微镜。分别用 FITC-抗 HA 抗体和罗丹明-B （RhoB）标记细胞和胶体几丁质。比例尺：10μm。上图，FITC抗HA抗体标记的ESA-3细胞与RhoB标记的胶体几丁质共孵育。下图，FITC-抗 HA 抗体标记的 ESA-几丁质体复合物与 RhoB 标记的胶体几丁质共孵育。
受纤维素分解微生物的酶-微生物协同作用的启发，已经构建了合成的ESA-几丁质体复合物，用于将几丁质协同降解为N-乙酰氨基葡萄糖。合成的 ESA-几丁质体复合物通过 SpyC/SpyT 相互作用在遗传编程的大肠杆菌表面上显示几丁质酶 BpChiA 和 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BlNagZ。通过调整 SpyC 部分的基因剂量，可以在细胞表面组装的酶的量进行调节，这说明了 ESA-3细胞具有高酶负载的潜力。在优化 BpChiA 和 SpyT 之间的连接子长度以及几丁质体中两种几丁质水解酶的比例后，与细胞表面单独组装的酶的混合物相比，ESA-几丁质体复合物从胶体几丁质中产生的 GlcNAc 在 3 小时内增加了 64% 。ESA-几丁质体复合物在实际应用中易于回收。我们观察到很大一部分ESA-几丁质体复合物与胶体几丁质颗粒共定位。这表明级联酶的共定位和三元几丁质-多酶-微生物复合物的形成对于解构难治性几丁质聚合物的酶协同作用至关重要。已建立的ESA-3表面组装平台可用于组装其他用SpyT标记的酶，使我们能够将酶多样性整合到合成的ESA-几丁质体复合物中。我们的策略还为分解其他顽固的生物质甚至塑料材料提供了途径。
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