Cryo-EM structure and rational engineering of a superefficient ochratoxin
A-detoxifying amidohydrolase
DOI：10.1016/j.jhazmat.2023.131836杂志：Journal of Hazardous Materials 文章链接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2023.131836
赭曲霉毒素A（OTA）是霉菌毒素之一，可以在青霉菌和曲霉菌属感染的多种农产品中检测到。OTA与严重的健康问题有关，包括致畸性、致突变性、免疫毒性、肝毒性和肾毒性，并被国际癌症研究机构列为可能的致癌物。许多国家和国际组织，如中国、巴西、美国、世界卫生组织和欧盟，都对各种农产品的OTA建立了严格的监管水平，通常在2-10μg/kg之间。因此，开发从受污染的农产品中去除OTA的有效方法引起了人们的广泛关注。
OTA在加热和烹饪过程中稳定，可以迅速吸收，但在人体内缓慢消除。物理、化学和生物方法已被应用于管理受污染食品和饲料中的OTA。然而，物理和化学方法（如活性炭吸收、γ辐照、nixtamalization、双氧水氧化和臭氧化）表现出多种缺点，如去除效率差、饲料适口性和营养价值降低、化学残留、有害物质的产生和成本高。已经鉴定出大量能够通过生物降解或生物吸附对OTA进行净化的微生物。然而，微生物需要特定的生长环境，可以改变产品的质量或产生未知的代谢物，对食品安全构成潜在风险，并限制其在OTA解毒中的应用。
基于酶的治疗为OTA解毒提供了一种安全、特异性、经济高效和环保的方法。已经表征了许多OTA降解酶，如羧肽酶（CYP）和酰胺水解酶（ADH），它们可以水解OTA的酰胺键，产生无毒的赭曲霉毒素α（OTα）和L-β-苯丙氨酸（Phe）。一些市售的水解酶，如脂肪酶、酰胺酶和蛋白酶，也能够水解OTA，但效率通常较低。据我们所知，最有效的商业水解酶CPA（67μg/mL蛋白质）需要1小时才能降解不到50μg/L OTA的10%，显示出基于酶的OTA去污的低周转率和高成本。因此，寻找更有效的OTA解毒酶对于开发更实用的OTA解毒策略是当务之急。
赭曲霉毒素A（OTA）是农产品中检测到的最普遍的霉菌毒素之一，对人类和牲畜健康构成严重威胁。使用酶进行 OTA 解毒是一种有吸引力的潜在策略。最近从嗜酸窄食单胞菌中发现的酰胺水解酶称为ADH3，是迄今为止报道的最有效的OTA解毒酶，可以将OTA水解为无毒的赭曲霉毒素α（OTα）和L-β-苯丙氨酸（Phe）。为了阐明ADH3的催化机理，研究求解了载脂蛋白、Phe结合和OTA结合的ADH3的单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，总分辨率为2.5–2.7 Å。通过结构、诱变和生化分析研究了OTA结合残基的作用。研究还合理地设计了ADH3，并获得了变体S88E，其催化活性提高了3.7倍。变体 S88E 的结构分析表明，E88 侧链为 OTα 部分提供了额外的氢键相互作用。此外，毕赤酵母中表达的变体 S88E 的 OTA 水解活性与大肠杆菌表达的酶相当，揭示了利用工业酵母菌株生产 ADH3 及其变体以进一步应用的可行性。这些结果揭示了ADH3介导的OTA降解的催化机理，为高效OTA解毒机制的合理设计提供了蓝图。为了揭示ADH3的底物-酶相互作用网络，我们首先求解了ADH3与Phe复合物的冷冻电镜结构，Phe被认为是OTA的底物类似物。在假定的底物结合口袋中观察到Phe的清晰电子密度图。残基 L218、H253 和 D344 与 Phe 的羧基和氨基形成氢键相互作用（图1A）。此外，残基 H253 和 H271 为 Phe 的苯环提供堆积力（图1A）。
接下来，我们试图通过将 ADH3 与 OTA 一起孵育来获得 OTA 结合复合物的冷冻电镜结构，但未能获得令人满意的结果，这可能是由于野生型酶的 OTA 周转率快。从ADH家族成员的序列比对推断，ADH3的残基D344应该是作为酸/碱来协调底物质子化的催化残基。事实上，将 D344 突变为 Asn 和 Ala 完全消除了 ADH3 活性（图1）。为了保留底物结合口袋的几何组织，我们选择求解变体 D344N 的 OTA 结合结构（图1B）。在底物结合口袋中可以清楚地观察到OTA的电子密度图。OTA位于双核金属中心上方，酰胺部分位于N344（3.6 Å）附近（图1B），这应该有助于催化反应。D344N/OTA、ADH3/Phe 和 ADH3 的结构彼此对齐良好，Cα RMSD 值约为 0.19 Å，表明 Phe 或 OTA 的结合诱导了最小的结构改变。此外，D344N/OTA和ADH3/Phe中的苯基位于基本相同的位置，表明后者的配合物应代表部分底物结合模式。在 D344N/OTA 复合物中，底物结合口袋由残基 S88、H163、V217、L218、H253、I325 和 V347 以及 6 个金属铁配位残基（H83、H85、H251、H271、K210 和 N344）形成（图 1B）。OTA 与残基 H251 和 H253、金属β和 L218 的主链形成极性相互作用（图1B）。此外，H85 与 OTA 的 OTα 部分形成π堆叠相互作用，而 H253 和 H271 为 OTA 的 Phe 部分提供 T 堆叠力（图1B）。
为了探究在D344N/OTA中鉴定出的底物结合残基的作用，构建了这些残基的Ala变体，并测量了它们的OTA水解活性（图1C）。变体H163A、L218A、H251A和H253A以及先前发现的变体（包括H83G、H85G和H271G）的催化活性基本消失。变体K210和V217A的催化活性分别降低了91%和70%。S88 和 I325 似乎对 OTA 的结合贡献较小，因为它们的 Ala 取代基显示出边际还原。值得注意的是，变体I325A的催化活性增加了34%（图1C），这可能是因为Ala的一个小侧链产生了更宽的空间来容纳OTA。![]()
图1 ADH3的酶-配体相互作用网络和 ADH3 变体的 OTA 水解活性。图中显示了（A）ADH3/Phe和（B）D344N/OTA复杂结构中的酶-配体相互作用网络。Phe、OTA、基质相互作用残基和金属离子（金属α和β）分别被着色为绿色、鲑鱼色、青色粗棒和红色球体。距离< 3.5 Å 用黑色虚线表示。（C） ADH3变体的酶活性。每次测定一式三份，并显示平均值，误差条代表标准偏差。WT，野生型ADH3。ND，检测不到。
研究内容二：ADH3的作用机理
通过结合上述所有结果，并与其他具有双核金属中心的ADHs的催化机理进行类比，提出了ADH3的催化途径（图2）。最初，金属β与OTA酰胺官能团的羰基氧相互作用，并使羰基极化以进行亲核攻击。随后，保守的D344的侧链从桥接氢氧化物中提取出一个质子，该质子应与两个金属离子配位。最后，去质子化的桥接氢氧化物攻击碳氮键，通过从质子化的 D344 中提供质子来裂解。
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图2 ADH3的催化机理。如图所示为保守残基D344。
研究内容三：基于结构的合理设计提高ADH3的催化活性我们通过修饰 OTA 结合残基以增强 ADH3 活性，进行了基于结构的合理设计。检查D344N/OTA的复杂结构表明，L218、V347和S88这三个活性位点残基比其他底物结合残基离底物更远。因此，我们假设改变这些残基以增加酶-底物相互作用可能对酶活性产生有益影响。靠近OTA的Phe部分的残基L218突变为极性或芳香族残基，试图分别为羧基或苯基环提供额外的亲水相互作用或堆积力（图3）。不幸的是，包括L218S、L218C、L218T、L218F、L218Y和L218W在内的所有变体的催化活性几乎被消除（图3），这可能是由于Ser、Cys和Thr的极性侧链以及Phe、Tyr和Trp的笨重侧链阻碍了OTA的结合和/或进入。接下来，我们用不同的带电残基替换 S88 和 V347，以引入与 OTα 部分的羟基的额外亲水相互作用（图 3）。OTA水解实验表明，变体V347D、V347R、V347H、V347E和V347K的催化活性几乎消失（图3）。对于 S88 变体，变体 S88D 和 S88R 的 OTA 水解没有改善（图 3）。另一方面，变体S88E、S88K和S88H的催化活性分别提高了3.7倍、2.4倍和1.3倍（图3）。
变体 S88E、S88K 和 S88H 活性的增强促使我们解决它们的冷冻电镜结构，以解决其作用机制的分子基础。非活性突变 D344N 也被引入到每个变体中，以获得 OTA 结合的复合物。研究成功地解决了D344N/S88E/OTA复合物结构，这表明残基E88与OTA的OTα部分形成氢键相互作用（图4）。这些额外的极性相互作用可能有助于 OTA 稳定以促进酶活性。尽管我们试图获得与OTA复合物的S88K和S88H结构的尝试没有成功，但有理由提出，这些变体的活性增强也可能是由与OTα部分的额外极性相互作用所贡献的。![]()
图3 ADH3工程。ADH3 和变体的相对酶活性是根据消耗的 OTA 量确定的，并以野生型 ADH3 的百分比表示。WT，野生型ADH3。ND，检测不到。插图描绘了发生诱变作用的三种氨基酸以及 OTA 的位置，其中 OTA 的 Phe 和 OTα 部分单独框定。
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图4 D344N/S88E/OTA复合物中的 OTA 酶相互作用网络。OTA、底物相互作用残基和锌离子（α和β）分别显示在鲑鱼、青色棒和红色球体中。距离< 3.5 Å 用黑色虚线表示。
研究内容四：P. pastoris表达酶的功能分析在酶介导的OTA解毒的进一步应用方面，需要在含有内毒素的实验室使用的大肠杆菌以外的蛋白质表达宿主中产生ADH3（和有益变体）。甲基营养酵母P. pastoris是一种强大的宿主，已被用于生产用于各种工业用途的重组蛋白。因此，我们构建了重组 P. pastoris 以产生 ADH3 和最有效的变体 S88E，并评估了重组酶的 OTA 水解活性。ADH3 和变体 S88E 均以分泌形式表达并纯化用于后续分析。OTA水解实验表明，P. pastoris表达的野生型和S88E的催化活性与大肠杆菌表达的对应物相当（图5）。此外，表达 S88E 的活性比表达大肠杆菌的 ADH3 高 3.7 倍（图5）。这些结果表明，以大肠杆菌为表达宿主获得的OTA水解活性和工程结果可以转化为工业酵母菌株P. pastoris，为进一步推进ADH3介导的OTA解毒的工业应用指明了方向。![]()
图5 大肠杆菌和牧草假单胞菌表达的野生型和变异型S88E的相对活性。WT，野生型ADH3。酶的相对酶活性是根据消耗的OTA的量确定的，并以P. pastoris表达的野生型的百分比表示。每次测定一式三份进行，并显示平均值，误差条代表标准偏差。
在这项研究中，我们报告了载脂蛋白、Phe 和 OTA 结合的 ADH3 的冷冻电镜结构，ADH3 是迄今为止已知的最有效的 OTA 解毒酶。结构信息说明了OTA的结合方式和ADH3的催化机理。基于复杂的结构，我们合理地设计了ADH3，并获得了升级后的S88E变体，其酶活性提高了3.7倍。这些结果为ADH介导的OTA降解的催化机制提供了分子见解，对于设计更高效的OTA解毒机制具有重要意义。此外，最有效的变异体S88E由P. pastoris有效表达，它被认为是一种“普遍认为是安全的”（GRAS）微生物，并广泛用于生产工业酶。应采用基因工程和发酵优化的策略来进一步提高松树中S88E的表达水平。S88E对不同OTA污染食品和饲料原料的消除效率有待进一步评估。此外，应优化S88E在工业应用中的解毒条件，以促进基于酶的缓解受污染农产品的OTA。
撰稿：孙宇轩
校稿：曹少攀
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