Differential temporal release and lipoprotein loading in B. thetaiotaomicronbacterial extracellular vesicles
研究背景
多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）是一种广泛用于研究拟杆菌的模式生物，属于革兰阴性菌，具有分解广泛的复杂碳水化合物的能力。多形拟杆菌释放大量细菌细胞外囊泡（BEV），这些囊泡含有特定的蛋白质组并与其环境相互作用。由于多形拟杆菌包含两个膜，这些囊泡可以根据形成其的相关膜发生进一步分裂。革兰氏阴性菌产生的非裂解型BEV主要是外膜囊泡（OMV），它们通过外膜起泡形成并含有特定成分。确定BEV的蛋白质组是揭示这些囊泡在各种生物过程和疾病背景下的分子组成、功能和潜在应用的有力工具，这可以帮助识别货物蛋白，例如毒力因子、酶和转运蛋白或参与信号通路、群体感应或通信机制的蛋白质，还可以研究潜在的酶活性、营养获取能力和其他功能特性。
研究摘要
研究内容
在补充有血红素（BHIH）的脑-心脏输注培养基中设置一式三份培养物，并监测培养光密度、固定细胞大小、颗粒计数和上清液脂质含量（图1a）。培养基中始终存在颗粒（图1b），尤其是在富含脂质的培养基中。这表明由于存在污染颗粒和脂质，在囊泡分析中需要避免使用复杂的培养基成分。因此，研究者配制了一种化学的培养基，用于不含动物源性产物的B. thetaiotaomicron的生长，被称为BDMr6。将该培养基中的颗粒和脂质浓度与BHIH、酵母提取物和胰蛋白胨培养基进行比较，BDMr6不含可检测的颗粒（图1b），该培养基可被用于进一步分析B. thetaiotaomicronBEV释放动态。
图1 颗粒和脂质分析显示了在BEV研究中使用复杂介质的局限性
研究内容二：化学成分确定的培养基中BEV的释放动力学
为了研究B. thetaiotaomicron是否产生不同类型的BEV，比较了使用BDMr6培养基和终点培养物在四个不同时间点收获的囊泡。监测了四种生长特征，在所有培养物中监测OD600，并分析了49小时收获的样品的其他特征（图2a）。生长动力学显示BEV缓慢释放4-6小时，之后观察到BEV的释放显著增加，接种后约10小时达到OD600峰值。此后，OD600值随着囊泡的持续释放而出现出乎意料的显著下降。
图2 分析化学成分确定的培养基中产生的B. thetaiotomicron BEV
在5小时内观察到的DNA水平的高变异性可能是由于接种过程中囊泡的残留，以及细胞向指数生长阶段的转变（图2b“总DNA”）。在接种过程中，细胞代谢与晚期细胞相当，并且在向指数期过渡期间释放的囊泡类似于晚期BEV的囊泡。5小时之后，没有证据表明BEV蛋白与脂质的比率随时间变化（图2c）。使用时间分辨比较蛋白质组学研究了纯化BEV的蛋白质组成（图2d），表明时间依赖性变化主要是由脂蛋白和细胞质蛋白的相对丰度变化驱动的。
图3 B. thetaiotaomicron BEVs的冷冻透射电镜分析
图4 B. thetaiotaomicron代谢物、BEV和CFU分析
研究人员开发了一种基于纳米荧光素酶的报告系统来评估脂蛋白掺入BEV中的情况（图5a）。在接种后5小时和24小时，针对单个培养物（一式三份）及其上清液定量来自这些构建体的纳米荧光素酶信号，代表生长和固定期（图5b），观察到纳米荧光素酶掺入BEV的负趋势，表明脂质化后半胱氨酸的C末端的带负电荷的氨基酸促进蛋白质掺入BEV中。当表达细胞质纳米荧光素酶时，生长阶段收获的上清液中未检测到发光信号，这可能是细胞裂解所致。生长阶段观察到更强的相关性，可能该时间点裂解囊泡的丰度较低。
图5 BEV掺入信号肽分析
撰稿：覃英梦予
校稿：曹少攀
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