具有强大磷酸三酯脱磷能力的CeO2@NC纳米酶：快速、选择性地比色检测对氧磷

CeO₂@NC nanozyme with robust dephosphorylation ability of

phosphotriester: A simple colorimetric assay for rapid and selective detection of paraoxon

研究背景

研究摘要

研究内容 

CeO₂@NC纳米材料的合成过程如图1a所示。选择Ce(SO₄)₂⋅4H₂O、葡萄糖和双氰胺(DICY)分别作为初始金属源、碳源和氮源。简单地说，在超声波的辅助下，将葡萄糖、DICY和不同量的Ce(SO₄)₂⋅4H₂O混合，得到均匀的溶液。自组装过程后，收集沉淀并干燥，得到白色粉末。最后，在氮气气氛下900°C下对粉末进行热解，得到各种CeO₂@NC纳米材料。采用透射电子显微镜(TEM)对制备的纳米材料进行了形貌表征。如图1b、c和S1所示，N-C和CeO₂@NC均表现出层状和褶皱结构，这与典型的石墨烯纳米片的结构非常一致。同时，X射线衍射(XRD)图中N-C纳米片在~26.2^◦和~43.5^◦处出现特征峰(图1g)以及FT-IR光谱中C - C和C - N基团的存在(图1h)也验证了小分子前驱体的石墨化过程，计算出N-C纳米片的面间距为0.34 nm。相比之下，CeO₂@NC在2θ = 28.4^◦，32.9^◦，47.4^◦，56.3^◦处显示出清晰的峰值，可以分别索引到CeO₂的(111)，(200)，(220)和(311)平面(PDF# 34-0394)。随着Ce (SO₄)₂⋅4H₂O添加量的增加，XRD谱图变得复杂，表明有其他含Ce物质的生成。

为了评估Ce物种的化学成分和状态，进行了X射线光电子能谱(XPS)高分辨率透射电镜(HRTEM)和拉曼测量(图1i和j以及表S1-S7)。如前所述， Ce(IV)被认为是水解反应的活性位点，高的Ce(IV)原子百分比有利于催化活性。如图S2所示，当Ce(SO₄)₂⋅4H₂O添加量为3.5 mM时，相应CeO₂@NC纳米材料的总Ce和Ce(IV)原子百分比最高。同时，284.6 eV (C1)处的强烈峰表明存在sp²非氧化/芳香碳环(图S3)。此外，元素映射图像(图1e和1f)显示，C(红色)、N(绿色)、O(黄色)和Ce(紫色)元素均匀分布在纳米片上。此外，HRTEM图像(图1d)证实了石墨碳结构和直径约5 nm的结晶CeO₂ NPs的存在。计算得到的0.31 nm的晶格间距与CeO₂ NPs(111)面的晶格间距相对应，这与根据Bragg定律的XRD结果一致。同时，在拉曼光谱中观察到的~459 cm-1处的锐带(图1j)代表了Ce-O键的F2g对称振动模式，这是具有萤石结构的CeO₂的典型特征。在~1327 cm^-1 (D波段)、~1587 cm^-1 (G波段)和~2700 cm^-1 (2D波段)出现的峰也表明石墨烯的形成。综上所述，上述结果有力地验证了在NC纳米片中嵌入结晶CeO₂的杂化CeO₂@NC材料的合成。

图1 (a) CeO₂@NC纳米材料的合成路线。(b) N-C的TEM图像。(c)和(d) CeO₂@NC的HRTEM图像。(e)和(f) CeO₂@NC的hrtem图谱分析。(g) XRD图谱。(h) FT-IR光谱。(i)各种纳米材料的XPS光谱。(j) CeO₂@NC的拉曼光谱。

研究内容二：磷脂酶模拟行为CeO₂@NC

图2 (a) CeO2@NC-mediated对氧磷水解示意图。(b)存在或不存在CeO2@NC时p- NP特异性测定的紫外/可见光谱和颜色变化。(c) Ce(SO4)2⋅4H2O加入量的影响。(d) CeO2@NC浓度为50、100、200、300、400、500μg/mL时的UV/Vis吸光度。(e) pH和(f)温度对对氧磷水解的影响。(g)回收CeO2@NC纳米酶的催化活性。CeO2@NC和对氧磷浓度分别为500μg/mL和100 μM。(h)随时间变化的UV/Vis吸光度:0、2、4、6、8、10、12、15 min。(i)随时间变化的相对催化活性。

研究内容三：CeO₂@NC、CeO₂和天然OPH的活性比较

为了证明CeO₂@NC的强大催化能力，我们选择了CeO₂和OPH作为对照。除了保持较高的天然酶催化活性外，MPNCs还具有pH可切换高温对CeO₂@NC和CeO₂纳米酶的催化活性都有积极的影响，但会使天然OPH失去部分活性。更重要的是，在相同条件下，即使在大剂量(10 mg/mL)下，CeO₂@NC纳米酶的催化活性也略高于OPH，远优于CeO₂。同时，研究表观反应速率来判断类磷酸酶的催化性能(图3b和c)，并进行不同对氧磷浓度下的稳态酶动力学测定(图3d和图S5c)。CeO₂@NC的表观米夏里斯常数(K_m)值为749.76μM，与天然OPH的表观米夏里斯常数(K_m)值805.56μM相当(图S5d)。综上所述，设计的CeO₂@NC纳米酶对CeO₂具有更强的催化活性和更高的稳定性。此外，还研究了pH、温度和贮存对纳米酶稳定性的影响。如图3e和f所示，CeO₂@NC纳米酶对pH(2-11)和温度(4-90◦C)具有很强的耐受性。在贮藏稳定性方面，CeO₂@NC在室温下贮藏30天后，其活性仍能保持原来的92%，优于OPH(48%)(图3g)。CeO₂@NC具有较高的催化活性和优异的稳定性，可作为天然OPH的替代候选物在各个领域得到广泛应用。

图3 (a) CeO₂@NC (0.5 mg/mL)、CeO₂(0.5 mg/mL，低)、CeO₂(10 mg/mL，高)和OPH (0.5 mg/mL)催化的类磷酸酶活性比较;CeO₂@NC和CeO₂催化活性的比较(附图:不同反应条件和纳米酶溶液的颜色)。37◦C下不同催化剂下p-NP在400nm处的吸光度随时间变化(b);(c) 70°c。(d) CeO₂@NC催化对氧磷水解的Michaelis-Menten曲线。各因素对CeO₂@NC和OPH催化性能的影响:(e) pH;(f) 温度和(g) 储存稳定性。

研究内容四：CeO2@NC具有磷酸酶样活性的机制

图4 不同CeO₂@NC催化剂的Ce(III)和Ce(IV)用量。(b) CeO₂@NC在AA不存在(A)和存在(b)情况下的催化活性。(c) CeO₂@NC的O1s XPS放大光谱。(d) N-C浓度分别为0、50、100、200和300 μg/mL时，对氧磷在270 nm处的UV/Vis吸光度。(e) CeO₂@NC类磷酸酶活性的机制。

研究内容五：对氧磷检测的比色法

利用CeO2@NC纳米酶出色的磷酸酶样活性，开发了对氧磷的比色生物传感技术。在对氧磷的定量分析中，随着对氧磷浓度的增加，400 nm处的最大吸收峰逐渐增强(图5a)，并伴有越来越明显的黄色。在3.0 ~ 100.0 μM的线性范围内，拟合方程为A = 0.0081c + 0.0014 (R²= 0.9979)(图5b)。而且，仅用肉眼就能直接观察到清澈的黄色，可用于OPs的快速检测。为了进一步评估该方法的选择性和特异性，我们引入了各种干扰成分，包括其他OPs(如甲硫磷、毒死蜱和异硫磷)和不同的离子/生物分子。如图S6d所示，高浓度的K⁺、Mg²⁺、Na⁺、葡萄糖、乙酸钠、赖氨酸和甘氨酸没有引起明显的颜色变化。此外，与OPs类似物、杀虫磷、毒死蜱和异硫磷的反应相比，仅对对氧磷有阳性结果(图5c)，因为显色底物pNP仅由对氧磷的去磷酸化反应产生，表明对氧磷具有突出的特异性。同时，从图5d可以看出，当分析物被类似的对硫磷取代时，也没有颜色变化，总之，上述结果有力地验证了CeO₂@NC检测对氧磷的特异性。此外，与已报道的方法相比，所构建的生物传感器在温和条件下可以很好地实现对对氧磷的选择性检测(表S9)。

图5 为基于CeO₂@NC纳米酶的对氧磷比色检测:(a)不同浓度对氧磷的紫外/可见光谱变化。(b)对氧磷检测的工作曲线(插图:含有不同浓度对氧磷的检测系统的照片)。不同底物对紫外/可见光吸光度的变化:(c)对氧磷、毒死蜱、异硫磷和杀虫硫磷;(d)对氧磷和对硫磷。

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