Sortase-Catalyzed
Protein Domain Inversion
DOI：10.1002/anie.202316777杂志：Angewandte Chemie International Edtion通讯作者：David J. Craik，昆士兰大学，澳大利亚文章链接：https://doi.org/10.1002/anie.202316777
转肽酶催化的反应为蛋白质和肽的位点特异性工程提供了一个工具箱。虽然枯草酶、胰蛋白酶和天冬酰胺连接酶是互补的替代品，但转肽酶A及其变体是最广泛使用的转肽酶。转肽酶作用于C端LPXTG识别基序（其中X是任何氨基酸），在Thr和Gly之间切割，并通过硫酯连接的酰基酶中间体，将LPXT连接到聚甘氨酸重复序列的N端胺上。在革兰氏阳性细菌中，转肽酶的天然功能是将蛋白质附着在肽聚糖中的五甘氨酸基序上，但这种能力可以被重新利用，催化任何C端LPXTG序列和N端聚甘氨酸序列之间的多种反应。转肽酶催化连接的应用包括蛋白质融合体的产生，蛋白质的固定和纯化，具有不同合成功能的合成肽的N端或C端附着在蛋白质上，内源性蛋白质修饰或利用工程排序酶变体进行蛋白质半合成，以及从头到尾的肽和蛋白质环化。结合其他蛋白质工程工具，包括p53二聚化结构域和SpyTag-SpyCatcher，转肽酶催化的连接也被用于生成复杂的纠缠蛋白拓扑。然而，所有这些先前的反应，都是在典型的N-C取向上进行的，限制了排序酶催化结扎的合成范围。为了利用转肽酶A生成非自然融合蛋白，以前的研究分别通过标准的N-to-C转肽化或肼水解反应在蛋白质末端附加带有点击手柄的肽或肼衍生物。在中间提纯之后，利用这些点击手柄来生产所需的聚变产物。最近的一种方法使用植物天冬酰胺内肽酶通过模拟C端N端Gly-Leu序列来进行C端到C端蛋白的直接连接，然而这些反应在蛋白质水平上是低效的。
蛋白质的拓扑转换和排列作为产生新的蛋白质功能或稳定性的策略引起了人们的极大兴趣。这些努力主要受到自然发生的翻译后修饰的启发，例如头尾环化，环状排列或套索状纠缠。这样的方法可以在实验中环状排列的情况下通过遗传编码实现，或在环化的情况下通过酶处理。这些先前描述的策略使多肽主链取向保持不变。本文描述了一种非自然的蛋白质排列，即蛋白质结构域反转，即蛋白质的C端部分在蛋白质的N端部分被酶从标准的N-to-C结构倒置为C-to-C结构。概念上最相似的生物学过程可能是由重组酶催化的DNA片段的倒置。研究人员使用工程转肽酶A（一种广泛使用的转肽酶）来实现这些倒置。反应在4 - 25°C的温和条件下有效进行，并且与完全异种生产的蛋白质底物兼容。
为评估C端附着的二胺是否可以模拟N端甘氨酸残基，从而实现选选酶催化的C端与C端连接，研究人员制备了带有末端乙二胺(Eda)的GGG或GGA序列的扩展C端SUMO变体。为生成这些蛋白，对SUMO -硫酯进行了氨基水解，它可以很容易地通过2-巯基乙磺酸盐(MES)诱导的内部蛋白裂解（图1A），通过缓冲液交换步骤进入缓冲液（20 mM HEPES, 50 mM NaOAc, 100 mM NaCl, pH 7.5)中添加20 mM MESNa和0.5 M Eda（图1B）。该反应在室温下孵育2-6小时，得到蛋白二胺偶联物。研究人员还制备了SUMO-GGG的水解变体作为对照，该变体具有羧基末端（图1B）。所有蛋白质底物都有N端脯氨酸残基，以确保不会发生意外的N - C连接。有了这些非规范底物，还继续研究了带有C端LPETGGH识别基元的纳米体(VHH6e)底物与SUMO底物的模型连接，该连接由七突变体排序酶A (SrtA-7M)催化。七突变体排序酶A是一种工程金黄色葡萄球菌排序酶A变体，具有更好的催化活性，并且不依赖钙。在50 μM的底物中分别添加SrtA-7M (5 μM)和不添加SrtA-7M (5 μM)，在100 mM HEPES缓冲液中，pH为7.5，在室温下进行2小时的反应。在含有二硫代苏糖醇（50 mM终浓度）的负载染料中煮沸后，通过SDS-PAGE分析反应，消除了可能观察到的硫酯连接的酰基酶中间体，结果显示具有羧基末端的对照SUMOGGG变异没有产生纳米体SUMO缀合物。含有SUMOGGA和含有C端Eda的SUMO-GGG的反应产生了C-到C端连接产物对应的较高分子量带，尽管水平较低（图1C；分别为5%和6%，由凝胶带密度分析确定）。考虑到GGG-Eda和GGA-Eda底物的反应水平相当，C端聚甘氨酸序列对于结联不是必需的。尽管如此，研究后续继续将其用作后续底物中的C端连接子。
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图1 转肽酶A催化C-to-C端蛋白-蛋白连接。A) C端Eda修饰蛋白的制备方案；B)重建了具有不同C端修饰的SUMO蛋白的ESI-MS谱；C) SDS-PAGE分析含有50
μM VHH6e-LPETGGH，50 μM SUMO 变体，±
5 μM SrtA-7M的反应，在100 mM HEPES缓冲液中，pH 7.5，室温下2 h。
研究内容二：SrtA-7M通过基于Eda的模拟N端甘氨酸催化C-到C端蛋白连接效率的提高
考虑到SrtA-7M处理LPETGGH序列后释放的GGH肽可以与C末端Eda的连接相竞争，探索通过添加Ni2+以NiSO4的形式淬灭这些副产物的可能性。当添加Ni2+时，产物形成水平提高了约3倍（图2A）。研究继续发现这些反应也可以在4°C下进行。在4℃下孵育22 h，产生的产物水平比室温下高，这可能是由于在此期间反应逆转率较低（图2B）。最后，观察到对反应pH的广泛耐受性，但在更高的pH值下提高了产物的形成水平，在pH 9.5时接近50%（图2C）。这种效率与典型的排序酶催化的N-to-C转肽化反应相当，在没有抑制反应逆转的情况下，当底物以等摩尔浓度供应时，可以达到约50%的最大产物生成效率。在与N端GGG的标准转肽的直接比较中发现，在Ni2+存在的情况下，C端Eda的连接优于在没有Ni2+的情况下的标准转肽。由于不抑制反应逆转的标准排序酶催化的转肽化反应已被广泛使用，因此获得的结扎产率足以用于实际应用。这些实验还揭示了pH对N-to-C转肽化反应的偏好，但与C
-末端Eda的连接相比，pH的影响要小得多。假设这可以用C端Eda和N端甘氨酸胺之间的pKa差异来解释。在随后的C-to-C末端连接实验中，研究人员通常选择8-8.5的反应pH，以保持更接近生理pH。结果发现这些反应也可以在低至5 μM的底物浓度下进行，表明对C末端模拟物的有效识别。这与联氨或胺衍生物的分类催化结合形成对比，这些结合需要在mM范围内的浓度，这表明，与这些先前的方法不同，C端Eda作为合法的N端底物模拟物起作用。增加含Eda底物的浓度，导致限制底物向产物的转化略有改善。最后通过ESI-MS确认了C-to-C端连接产物的身份。
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图2 改进转肽酶A催化的C-到C端蛋白连接。A) SDS-PAGE分析含有50 μM VHH6e-LPETGGH，50
μM SUMO-GGG-Eda，5 μM SrtA-7M，1 mM NiSO4的反应，在100 mM HEPES缓冲液中，pH 7.5，室温下0.5，1或2 h；B)反应如(A)所示，在4℃或室温下运行22h；C)反应如(A)所示，在4°C和不同pH值下运行17小时。pH 7.4的反应在磷酸盐缓冲盐水中进行，而不是HEPES缓冲液。
研究人员试图通过生成纳米体异二聚体来证明C-到C端连接的更实际的用例。纳米体的N端位于其抗原结合面附近，因此某些N端与C端融合已被证明会影响抗原结合能力，而C端与C端融合则不会影响抗原结合能力面临着镇定。选择VHHMHCII和VHH6e纳米体作为例子。VHHMHCII在专业抗原呈递细胞上结合主要组织相容性复合体(MHC) II类分子，在自身免疫性疾病或疫苗开发中用于递送自身抗原以产生耐受性。VHH6e结合14个氨基酸标签QADQEAKELARQIS （6e标签），因此VHHMHCII-VHH6e C - C端融合可以快速筛选6e标记的MHCII分子的递送。研究人员使用了用C端LPETGGH序列修饰的VHHMHCII和用C端GGG-Eda序列修饰的VHH6e。在pH为8时，将SrtA-7M和Ni2+以1:1的比例（50 μM）加入到这些蛋白底物中，观察到37%的C-to-C端连接产物的转化率（图3A）。我们可以很容易地通过单一尺寸的排除层析步骤（16/
600 Superdex 75 pg）纯化该产品，并通过ESI-MS确认预期的产品结构（图3A和B）。
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图3 C-到C端连接的纳米体二聚体的产生。A) SDS-PAGE分析含有50
μM VHHMHCII-LPETGGH，50 μM VHH6e-GGG-Eda，5
μM SrtA-7M， 1 mM NiSO4的反应，100 mM HEPES缓冲液，pH 8，4°C，16.5 h。将含Ni2+的反应按比例放大，通过粒径隔离层析纯化产物，并进行SDS-PAGE分析；B)重构了纯化的C-to-C末端连接纳米体异源二聚体的ESI-MS谱。
研究内容四：串联转胺简化蛋白质底物的制备方法和C-到C端蛋白-蛋白连接的分子内反应评估
鉴于之前的策略需要通过内接制备两种蛋白质底物中的一种，即使是同型二聚体的产生也需要制备和表达两种不同的结构体。为简化方法，开发了另一种基于串联转胺的策略，其中SrtA-7M最初将Eda连接到蛋白-
LPETGGH底物上，定量产生蛋白-LPET
-Eda（图3C），随后将蛋白- LPETGGH连接到蛋白-
LPET -Eda上，生成C端到C端连接产物。使用VHH6e证明该种方法，尽管在Eda之前缺乏C端连接器，但其转化为同型二聚体的转化率达到了21%。通过ESI-MS确认了产品质量。这种策略可以使用现有的LPETGGH标记的蛋白质直接获得C-到C-末端的融合。
在建立了分子间C-到C端蛋白-蛋白连接的高效排序酶催化方法后，进一步评估进行分子内反应的可能性。在分子内情况下，识别序列位于蛋白质的中间区域，单个酶促步骤将产生一种产物，其中作为识别序列C末端的蛋白质部分相对于N端部分相对于氨基酸主链取向是倒置的（方案1C）。为举例说明这种拓扑结构，研究人员表达了前面示例中使用的两种纳米体(VHH6eVHHMHCII)的融合蛋白，其中包含中间LPETGGH序列，然后是因子Xa
(FXa)。裂解位点和C端GGG-Eda基序（图4A）。因此，FXa的切割允许将未加工的融合蛋白底物从C-区分到最终重排的产物（图4A）。结果发现不含SrtA-7M的反应只产生FXa衍生的裂解产物，而含SrtA-7M的反应产生20%的反向产物（图4B）。Ni2+的加入使这一比例进一步提高到34%。相对于在类似的蛋白质底物上进行的分子间反应（图3A），看到在没有Ni2+的情况下，这些转化反应的产物形成水平更高(20%
vs 9%)。这种改进可能是由于与这些反应的分子内性质相关的邻近效应。然而，研究也观察到形成了更高分子量的条带，可以通过FXa切割来分辨（图4B），这表明分子间存在竞争性连接。很容易地通过单一尺寸的排除色谱步骤纯化结构域倒置产物，并通过ESI-MS分析证实它是C-to-C末端连接和FX分裂（图4C）。这些排序酶催化的蛋白质拓扑倒置因此构成了一种新型的非自然蛋白质排列。![]()
图4 转肽酶A催化的蛋白质结构域反转。A)转肽酶A催化的蛋白结构域倒置方案，通过FXa催化的蛋白水解实现产物判别；B)
SDS-PAGE分析含有50 μM VHH6e-VHHMHCII-GGG-Eda， 5
μM SrtA-7M，1 mM NiSO4的反应，在100 mM HEPES缓冲液中，pH 8.5，在4°C下反应22 h。
综上所述，N-CNDs作为一种低成本的无金属碳基纳米酶，有望在消毒、灭菌、环境修复和其他伤口愈合应用中成为一种极有前途的材料。
本研究证明在蛋白质C端模拟N端甘氨酸允许排序催化C-到C端连接。所描述的蛋白质结构域反转构成了一种新型的蛋白质排列，这些进展有望成为蛋白质修饰技术工具箱中有价值的补充。
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