DRAGON: Harnessing
the power of DNA repair for accelerating genome evolution in Corynebacterium
glutamicum
DOI：10.1016/j.ymben.2023.08.002文章链接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2023.08.002
基因组DNA因暴露于各种环境和内源因素而不断遭受损伤，需要进行修复，以避免突变对生物的有害积累。为了防止这些DNA损伤的潜在有害影响，微生物细胞已经开发了不同的DNA修复机制来抵消DNA损伤和维持基因组的稳定，如碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MMR)、重组修复(RR)、直接损伤逆转和SOS反应。越来越多的证据表明，由无效的DNA修复引起的遗传变异也可能偶尔产生更合适的突变，并潜在地加速适应性进化。以高自发突变率为特征的超突变被发现是获得抗菌素耐药性、致病机制等新功能的关键因素，支持超突变因子在驱动应激反应中的快速适应中所起的重要作用。因此，允许出现超突变的策略将给宿主细胞带来挑战和机会，以获得更好的适应能力。
作为一种重要的GRAS(通常被认为是安全的)微生物，谷氨酸棒杆菌已经成为大规模生产各种氨基酸、有机酸、二胺和酒精的主力。一项对DNA修复系统的比较研究表明，尽管DNA修复成分的类型和数量略有不同，但主要的DNA修复途径在谷氨酸杆菌基因组中是保守的，尤其是与BER、NER和RR修复通路相关的大多数同源基因都存在于谷氨酸棒杆菌中。
在本研究中，我们对谷氨酸杆菌的DNA修复相关基因进行了系统的分析，旨在找出对自发突变频率有显著影响的关键DNA修复靶点。结果表明，nucS、xpb、tag基因的缺失和dinP基因的过表达导致了自发突变频率的急剧增加，揭示了它们在维持谷氨酸杆菌DNA保真度和基因组稳定性中的重要作用。在这些发现的鼓舞下，我们提出了一种持续有效的进化工程方法，称为DNA修复辅助基因组进化(Dragon)。作为一种概念验证，Dragon可以成功地用于提高谷氨酸杆菌对多种胁迫的耐受性，如卡那霉素、酸性pH和高底物/产物浓度，显示了其在菌株改良方面的宝贵潜力。
超突变是一种以高自发突变率为特征的强健表型，已被证明通过搭乘有利突变的便车来快速适应应激环境。越来越多的证据表明，DNA修复缺陷会导致细菌发生超突变事件。在这里，我们提供了一个全面的DNA修复系统的调查，以确定有希望的目标，以确保高保真的DNA谷氨酸棒杆菌。四个有效的DNA修复因子，包括nucS、tag、xpb和dinP，被发现与超变表型的发生密切相关，然后这些靶点被设计成一个基于CRISPRi的用于基因组突变的一体化质粒系统。基于这些发现，我们提出了一种新的进化工程方法--DNA修复辅助基因组进化(Dragon)。作为概念验证，Dragon策略被成功地应用于促进谷氨酸杆菌快速获得微生物健壮性，例如对卡那霉素、酸性pH和高L-丝氨酸的耐受性增加，显示了其在快速菌株改良方面的前景和潜力。总体而言，我们的研究将为理解谷氨酸杆菌的DNA修复和进化适应提供新的见解。
研究内容一：探索DNA修复因子可产生高自发突变频率在大多数生物体中，通过各种错误减少机制，在自然条件下，自发突变水平通常相当低，以确保DNA复制过程中的高保真。在这些策略中，DNA修复是重要的细胞守护者，对于基因组的稳定和生物体的生存是不可或缺的。在这项研究中，我们旨在系统地挖掘和识别明显影响自发突变频率的DNA修复相关基因。为了探索新的突变避免因子，总共评估了45个与DNA修复相关的候选基因(表1)，包括BER中的12个靶点，NER中的5个靶点，MMR中的3个靶点，RR中的4个靶点，SOS反应中的5个靶点，以及其他修复途径中的16个靶点。
编码核糖核酸聚合酶β亚单位的rpoB基因突变已被证明与利福平耐药(RIFR)表型密切相关。正如先前报道的那样，rpoB基因的大多数基因突变存在于81bp的热点区域(图1A)。在这里，我们发现在谷氨酰胺中维持低水平的自发突变需要多种DNA修复基因，如BER途径中的tag、ung、tag
A2、fpg靶，NER途径中的xpb靶，MMS途径中的nucS靶，SOS途径中的dinP靶，以及其他预测修复机制中的cg1318、recB、cg2321靶(图1B-F和补充图S1)。特别是，结果表明tag(编码DNA-3-甲基腺嘌呤糖基酶)、xpb(编码DNA切除修复蛋白ERCC-3)、nucS(编码核酸内切酶)或过表达dinP(编码DNA聚合酶V)有助于获得RIFR超突变表型，显示出谷氨酸杆菌自发突变的急剧增加(图1G)。与野生型菌株的低突变率(3.59±1.62×10-8)相比，tag、xpb、nucS和dinP基因过表达的自发突变率分别增加到1.89±0.70×10-7、1.16±0.31×10-6、0.91±0.19×10-5和3.66±1.32×10-7，分别是野生型对照的5.3倍、32.3倍、253.5倍和10.2倍。![]()
图1 与谷氨酸杆菌自发突变事件相关的高效DNA修复相关成分的鉴定。
研究内容二：DNA修复机制的组合工程以增强遗传变异基于DNA修复因子的上述发现，我们选择了nucS、tag、xpb和dinP等靶基因进行组合诱变。为了更好地评价dinP靶标在维持基因组保真度方面的作用，我们构建了dinP过表达菌株Ptuf-dinP，用一个强大的结构性TUF启动子取代了它的天然启动子。与含有pXMJ19-dinP的野生型菌株一致，pTUF-dinP菌株的平均自发突变频率为3.83±1.21×10-7。如图2A所示，tag、xpb靶标的额外缺失或dinP靶标在背景株中的过表达使突变率略有增加，分别为1.18±0.19×10-5、1.66±0.19×10-5、1.83±0.19×10-5，分别是nucS对照株的1.3倍、1.8倍和2.0倍。此外，在另一个PtufdinP背景株中，tag和或xpb靶标的额外缺失也进一步增加了突变率，分别为1.12±0.19×10-6(2.9倍)、2.29±0.73×10-6(6.0倍)、3.36±0.75×10-6(8.8倍)。这些发现支持了这些目标基因的组合工程促进了更大数量的超可变种群的获得。与此一致的是，同时缺失nucS、tag、xpb和高表达dinP的突变株自发突变频率最高(3.01±0.68×10-5)，约为单一缺失株(0.91±0.19×10-5)的3.3倍。
为研究上述DNA修复因子引起的碱基替换突变类型，对rpoB基因的利福平耐药决定区进行了序列测定。结果表明，A-G和C-T转换似乎是最常见的碱基替换，占突变类型的95%以上(图2B)。此外，尽管频率很低，但在ΔnucSΔtagΔxpb-PTUF-dinP背景株中也观察到了其他碱基替换，如A到T和C到G的转换。
在大多数生物体内，GT错配被认为是DNA复制错误过程中常见的频繁事件。至少一些容易出错的DNA聚合酶被发现优先产生碱基转移突变。因此，我们推测，A-G和C-T碱基转换的高发生率可能部分归因于DNA修复缺陷细胞中存在GT错配(图2C)。这些发现与其他研究的结果一致，这些研究表明，基于非规范的EndoMS/nucS的错配修复系统可以有效地修复频繁发生的GT错配。![]()
图2 组合突变对突变特征的影响。
研究内容三：基于CRISPR干扰的nucS基因表达抑制平台鉴于核糖核酸内切酶在DNA复制过程中维持基因组保真度的重要性，我们试图开发一种基于CRISPR-dCpf1的基因抑制系统来抑制nucS基因的表达，以获得高突变表型。CRISPR-dCpf1系统包含在组成性PJ23119启动子控制下针对nucS基因的特异性crRNA，以及在PlacM启动子控制下的dCpf1变体(图3A)。此外，还将温度敏感型谷氨酸棒杆菌复制子pBLTS和大肠杆菌复制子pSC101引入到质粒中，作为一种有效的高温固化策略。为了测试CRISPR-dCpf1系统的效果，设计了四种不同的针对nucS基因位置的crRNA(图3B)。结果表明，dCpf1-gRNA复合体抑制子的结合链和位置偏差对基因抑制的影响略有不同。然而，针对ATG翻译起始密码子附近的nucS ORF区域的crRNA2显示出最高的自发突变频率(0.88±0.16×10-5)，几乎是没有crRNA对照(3.72±0.95×10-8)的236.6倍(图3C和D)。此外，其他crRNA导致不同的阻遏效率，但都增加了对利福平耐药的表型。与上述突变率一致的是，进一步的qPCR分析表明，nucs基因的mRNA水平分别显著下降了81%、88%、75%和26%(图3D)。这些结果表明，通过基于CRISPR-dCpf1的基因抑制系统，降低nucS内切酶的表达水平，可以有效地引起谷氨酸棒杆菌的高突变状态。![]()
图3 基于CRISPR干扰的nucS基因抑制平台。
基于上述CRISPRi系统，我们进一步评估了针对翻译起始点附近的tag或xpb
ORF区域的crRNAs在突变发生时的有效性。如图4A所示，降低tag或xpb的表达水平会导致自发突变频率分别增加至8.81±3.38×10-8、2.80±1.28×10-7，较对照水平(3.08±1.11×10-8)分别提高2.9倍和9.1倍。
因此，在这些初步发现的鼓舞下，我们决定开发一个一体化的质粒系统，其中crRNA盒被设计为同时靶向nucS、tag、xpb基因座，并且在强大的Ptuf启动子的控制下dinP基因过表达(图4B，补充图S2)。不出所料，携带一体质粒的谷氨酸杆菌菌株的自发突变率显著增加(1.97±0.9×10-5)，约为野生型对照菌株的548.3倍。对于利福平平板法，使用或不使用一体化质粒系统时，利福平耐药克隆的数量有显著差异(图4C)。此外，与野生型对照相比，质粒治愈的菌株表现出相对较低的自发突变频率。与突变频率显著增加相一致的是，qPCR分析还表明，nucS、tag和xpb基因的mRNA水平分别下降了80%、75%和78%，dinP基因的转录水平上升了6.4倍(图4D)。综上所述，一体化质粒系统有望成为产生谷氨酸杆菌超突变表型的有力工具。![]()
图4 构建可提高突变率的多合一质粒型系统。
研究内容五：Dragon在提高微生物应激耐力方面的概念验证为了验证Dragon在改善菌株性能方面的可行性，分别使用由ΔnucSΔtagΔxpb-Ptuf-dinP背景驱动的超变菌株和All-in-One质粒作为微生物宿主以增强稳健性。如图5A所示，在逐步增加卡那霉素浓度后，超变菌株和它们的正常突变对照经历了连续的进化和表型选择。经过5轮传代后，卡那霉素抗性的稳健性迅速而显著地提高，尤其是在较高浓度的卡那霉素胁迫下。如图5B所示，超变菌株表现出对酸性胁迫的适应性增强，pH值依次降低。同样，通过Dragon系统在进化品系中进行短期连续传代实验，也实现了对高浓度L-丝氨酸的出色耐受性(图5C)。
为了进一步研究进化菌株的表型特征，我们选择了从Dragon系统获得的耐酸进化菌株为例。正如对低pH胁迫的抗性增强所预期的那样，在测试的酸性pH条件下，进化菌株达到了比亲本对照菌株更高的生物量浓度(图6A)。与这些观察一致的是，当受到杀伤性酸性pH的影响时，进化菌株显示出比亲本对照显著提高的细胞存活率(图6B)。同时，进化菌株在酸休克后的指定时间点保持了比其亲本对照更高的细胞内pH值(图6C)。此外，定量PCR分析显示，与野生型对照相比，进化菌株中参与戊糖磷酸途径(PPP)和三羧酸(TCA)循环的代表性基因，包括tkt、zwf、acn、icd和odhA的表达水平都有所提高，这意味着进化菌株可能专门设计了优化中心碳通量的基因，以更好地适应酸性pH(图6D)。为了进一步了解耐酸突变株的基因组特征，我们对进化的菌株进行了全基因组重新测序。在耐酸进化株基因组中共观察到169个单核苷酸多态(SNPs)，包括98个非同义SNPs，48个同义SNPs，2个停止获得/丢失突变和21个非外显子突变(图6E)。我们还通过分析所有的SNP估计了突变偏向，并进一步支持了上述观点，即A-G和C-T突变是最常见的碱基替换，占总突变类型的92%以上(图6E)。此外，在基因组中也观察到了一些其他合理的修饰，如结构变异(SVS)和小插入/缺失(INDel)，但几乎所有这些修饰都发生在转座酶区域，它们的功能仍有待于未来的研究(数据未显示)。综上所述，这些结果表明，从Dragon系统获得的进化菌株具有更好的耐酸性能，其基因组确实包含各种修饰，特别是SNPs。![]()
图5 Dragon策略对提高谷氨酸棒杆菌微生物健壮性的意义。
![]()
图6 Dragon策略获得的耐酸突变株的特性。
在这篇文章中，我们进行了DNA修复系统的比较分析，以确定有希望的目标基因，以确保高DNA保真度和基因组稳定性。通过设计四个有效的DNA修复相关基因：nucS、tag、xpb和dinP，我们提出了一种名为Dragon的方法来产生超变异体来促进应激进化。与经典的实验室进化相比，Dragon使生物体能够更快地适应压力环境，显示了其在菌株改良方面的前景和潜力。此外，考虑到DNA修复途径的许多组成部分在物种之间高度保守，通过类似的Dragon方式利用无效DNA修复的力量可能为加速适应性进化过程提供了一种普遍的策略。
![]()
