Modulating
commercial pea protein gel properties through the addition of phenolic
compounds
DOI：10.1016/j.foodhyd.2024.110123 文章链接：https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2024.110123
由于豌豆蛋白的凝胶强度低，因此在致密食品中的使用受到限制。在有利于共价键合的碱性条件下（pH 9，24小时），用酚类物质对商用豌豆蛋白进行改性。选择了三种分子大小不同但结构单元相似的酚类化合物（没食子酸，0.17 kDa；表没食子儿茶素没食子酸酯，0.458 kDa；单宁酸，1.71 kDa），以更好地了解分子量和添加的羟基和芳香族基团对胶凝特性的影响。通过改变酚类物质的浓度（0-4 mM）研究了剂量对胶凝特性的影响。用单宁酸制备的结合物发生了最大变化：颜色，ΔE 38；结合位点浓度降低，43%；溶解度，31%。凝胶强度的最大增加量为 16 倍，从 3.0 增加到 48 kPa。结果与添加的酚类化合物的质量浓度、分子量和羟基的近似数量呈正相关。用酚类化合物改性豌豆蛋白可以像添加增稠剂一样有效地提高凝胶强度。为了增加豌豆蛋白凝胶的弹性，添加的酚类化合物浓度不应超过 1.36 g/L，相当于蛋白质质量的 3.8 wt%。我们证明了用酚类化合物改性豌豆蛋白是一种有用的工具，可以根据分子量和添加的酚类化合物的剂量来调整凝胶强度和弹性。
豌豆蛋白越来越多地被用作大豆蛋白的替代品，因为豌豆植物可以在更温和的气候下生长。但与大豆蛋白凝胶相比，豌豆蛋白凝胶“的强度较低，限制了其在食品中的应用。例如，在pH 7下，大豆蛋白形成的凝胶几乎是用豌豆蛋白形成的凝胶的3.5倍，并且豌豆蛋白的临界凝胶浓度高于大豆蛋白。因此，提高凝胶强度的方法越来越受到关注，例如酶交联和添加增稠剂。蛋白质的功能也可以通过与酚类化合物结合来调节。
豌豆天然含有酚类化合物。豌豆种子特别富含酚酸，如对羟基苯甲酸、原儿茶酸、没食子酸°(GA)阿魏酸和绿原酸，豌豆英也富含较多的酚类物质，如单宁。豌豆英中的酚类含量范围为4.0至32 mg/g。豌豆英中总蛋白质含量占其重量的20%至27%，总酚类含量占总蛋白质质量的2%至16%。酚类化合物包括带有一个或多个羟基取代基的芳环。它们可以作为简单的酚类分子、多环芳烃分子和高度聚合的化合物存在。蛋白质和酚类化合物之间的相互作用可以是非共价的或共价的。共价键可以通过使用碱性条件诱导酚类化合物上的羟基去质子化而形成醌。一旦这些醌形成，它们就会与其他酚类化合物共价反应，从而产生深色的二聚体和较大的多酚类化合物。。在蛋白质存在的情况下，醌与氨基酸侧链共价反应特别是赖氨酸的游离氨基和半胱氨酸的巯基，导致深棕色、黄色或绿色。也有关于色氨酸残基修饰的报道。共价蛋白质-酚类相互作用产生的产物称为偶联物。
制备的样品随着酚类化合物的添加量增加，颜色（ΔE）逐渐变化。图1显示了结合后获得的冻干粉末。PPI 粉末最初颜色较浅（L 值 ≥ 70），几乎呈白色，略带黄色（a* 值接近 0，b* 值 ± 20）。PPI-酚类结合物颜色较深（L 值 ≤ 45，a* 和 b* 值无明显变化），呈棕色。当 ΔE ≥3.5 时，没有经验的观察者可以注意到样品之间的颜色差异。当 ΔE ≥5 时，观察者会注意到两种不同的颜色。GA 的最大颜色变化（ΔE）为 28，EGCG 为 31，TA 为 38。因此，在添加的最高酚浓度 (4 mM) 下，最大的酚类化合物 TA (GA，0.17 kDa；EGCG，0.458 kDa；TA，1.7 kDa) 的颜色差异最大。这可能表明，较大的酚类化合物和高酚浓度的 PPI 发生了更大的改变。它也可能表明仅由酚氧化引起的着色。为了排除后一种可能性，测量了蛋白质上潜在结合位点的变化。
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图1 结合豌豆蛋白的冻干粉
酚类化合物与蛋白质的碱性孵育通常会导致酚类化合物氧化，并可能导致蛋白质随后发生共价修饰。然而，对于这种商业 PPI 中存在的不溶性大型植物蛋白聚集体，结合方式（共价和/或非共价）难以评估。我们进行了各种尝试，以获取有关本研究中使用的 PPI 修饰的更多信息。酚类化合物与蛋白质的共价结合通常通过化学分析来验证。专注于碱性条件下反应性最高的结合位点，以确认共价修饰；即半胱氨酸（SH 基团）和赖氨酸（NH 基团）。在与浓度不断增加的酚类化合物孵育之前和之后，使用 Ellman 测定法测量 PPI 中游离硫醇基团（SH 基团）的浓度。不幸的是，半胱氨酸的浓度低于或接近该测定的检测限（未显示结果）。半胱氨酸浓度低可能是因为 PPI 已经变性并可能聚集，这会阻止游离硫醇基团的暴露。此外，PPI 本来就局限于半胱氨酸残基。因此，我们假设结合位点的数量主要由赖氨酸的游离氨基决定。图2显示了使用 TNBS 测定时游离氨基浓度随添加的酚浓度的变化。当 PPI 用酚类化合物改性时，游离氨基的数量会减少。当使用高分子量酚类化合物 TA 时，这一点最为明显。添加 GA 导致游离氨基的减少量最少。当将值标准化为 PPI 参考值（即 100% 未改性或 0% 改性）时，可以估算出已发生反应的氨基的比例。研究发现，用 GA 制备的结合物可以与 23% 的结合位点发生反应，EGCG 为 33%，TA 为 43%。我们从这些结果得出结论，较大的酚类化合物可以结合多个氨基（无论是同一蛋白质还是不同蛋白质之间）。![]()
图2 未经酚类物质改性的豌豆蛋白（参考，黑色）、经没食子酸改性的豌豆蛋白（GA，绿色）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，橙色）和单宁酸改性的豌豆蛋白的游离氨基浓度（μM）与添加的酚类物质浓度（mM）的比较
酚类物质与蛋白质的结合与所用酚类物质的分子量和游离羟基数量有关。Folin Ciocalteu 法可用于测量酚类物质的浓度，该浓度可与游离酚羟基的浓度相关联。酚类物质每个活性 OH 基团的摩尔吸光度和确切的氧化产物尚不清楚。因此，酚类物质的浓度未转化为游离酚 OH 浓度。然而，与未改性 PPI 相比，结合物中酚类物质的浓度（以及游离酚 OH 基团的近似浓度）相对增加可能表明共价连接，因为所有样品都经过了广泛的透析以去除未结合的酚类物质。因此，测量了每种结合物的总酚类浓度（图 3）。预计在分子浓度相同的情况下，每分子中游离酚羟基最多的酚类化合物与 Folin 试剂的吸光度会更高。碱处理之前，GA（0.17 kDa）在苯环上有 3 个游离羟基，而 EGCG（0.458 kDa）有 8 个，TA（1.7 kDa）有 25 个游离羟基。因此，当添加相同分子浓度的酚类化合物时，预计 PPI 结合物测得的酚类化合物浓度最高，其顺序为 TA > EGCG > GA。
随着添加的酚浓度增加，用 TA 和 EGCG 制备的结合物中的酚浓度增加，因此游离酚羟基也增加（图 3）。在相同的添加酚浓度下，从 0.08 mM 开始，TA 测得的酚浓度高于 EGCG 和 GA。在最高添加酚浓度（4 mM）下，测得的最高酚浓度为 TA 9137 μM，其次是 EGCG 4305 μM 和 GA 2337 μM。对于用 GA 制备的结合物，与 PPI 参考浓度（2623 μM）相比，酚浓度没有增加。这证实了，在相同的 TA 分子浓度下，与 EGCG 和 GA 相比，检测到的游离酚羟基更多，并表明酚类化合物的分子结构影响测定的吸光度。所有三种酚类化合物很可能都经历了氧化反应，生成醌，随后又发生了缩合和蛋白质结合反应，从而降低了参与福林反应的 OH 基团含量。因此，PPI-GA 结合物中酚含量的轻微下降是由于氧化过程中游离 OH 基团的损失所致。小分子酚类化合物的游离 OH 基团相对损失大于大分子酚类化合物，这就是为什么这种影响在 PPI-EGCG 和 PPI-TA 结合物中没有出现的原因。这已通过仅由氧化酚类化合物制成的校准曲线得到证实。酚类化合物的吸光度最高，顺序为：氧化 TA > 氧化 EGCG > GA > 氧化 GA。因此，福林法似乎更适合检测大分子酚类化合物的共价结合，而不是小分子酚类化合物。![]()
图3 测量的酚类化合物浓度（μM）与未添加酚类物质（参考，黑色）、添加没食子酸（GA，绿色）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，橙色）和单宁酸（TA，棕色）的豌豆蛋白的添加酚类物质浓度（mM）进行比较
研究内容三：PPI改性对胶凝性能的影响
图4说明了加热和随后冷却对 PPI 和改性 PPI 分散体的影响。图中以未改性 PPI 和 4 mM PPI-TA 缀合物（最广泛改性的缀合物）的凝胶化行为为例。观察图 5 中的凝胶化行为，我们发现 G′ 始终大于 Gʺ，没有发生模量交叉。这表明主要为固体状行为，表明在加热之前从一开始就形成了物理凝胶。对于豌豆蛋白凝胶，网络形成主要依赖于物理键合，例如氢键和蛋白质分子之间的疏水相互作用，当蛋白质通过加热展开时，这种键合会增强。因此，人们通常会观察到豌豆蛋白在加热过程中凝胶结构会增强。热处理之前，在 PPI 中可以看到球形和空心的蛋白质聚集体和颗粒（图 4），这与之前的观察结果一致，表明 PPI 可能进行有限的额外展开。热处理后，在 PPI 中观察到蛋白质聚集体和颗粒的融合（图 4），但并没有增加蛋白质之间已经存在的物理相互作用。相反，热处理暂时削弱了蛋白质凝胶，随后的冷却使其恢复了原有的强度。冷却时凝胶强度的恢复表明蛋白质聚集体之间重新形成了吸引力。此外，对于富含游离硫醇基的蛋白质，当凝胶结构完全冷却时，由于二硫键的形成，模量会随着时间的推移而增加。结果表明，本研究中使用的 PPI 的凝胶化过程主要涉及聚集蛋白之间的非共价相互作用（即氢键和疏水相互作用）。![]()
图4 左侧y轴上以Pa为单位表示模量 G′（实线）和 Gʺ（虚线）与时间（分钟）的关系
随着 PPI 改性程度的提高，可以看到凝胶强度（温度扫描结束时获得的 G’）逐渐增加（图 5A）。TA 结合物的平均凝胶强度最大增幅为 48 kPa，与未改性 PPI（3.0 kPA）相比显着增加。EGCG 结合物的最高平均凝胶强度为 22 kPa，GA 结合物的最高平均凝胶强度为 9.7 kPa。其他研究也发现了类似的结果，其中较大的酚类物质比单酚类物质更有效地增加肌原纤维蛋白、大豆蛋白和银杏籽蛋白的凝胶强度。当将凝胶强度与酚类化合物的质量浓度作图时（图 5B），得到了一条主曲线，该曲线显示了酚类化合物的质量添加对弹性模量的影响的一般模式，而与所选的酚类化合物类型无关。因此，似乎质量比比酚类化合物和蛋白质的摩尔比更能描述对凝胶强度的影响。只有当一个较大的酚类化合物分子可以与蛋白质中的几个结合位点结合时，这才有可能。这意味着对于本研究中使用的酚类化合物，一个 TA 分子能够结合大多数位点，其次是 EGCG，最后是 GA。![]()
图5 测量的 G' 模量表示为凝胶强度 (Pa)，在施加温度扫描后与 (A) 添加的酚浓度 (mM) 和 (B) (g/L) 进行比较，其中 (A) 添加的酚浓度为没食子酸 (绿色/点)、表没食子儿茶素没食子酸酯 (橙色/正方形) 和单宁酸 (棕色/三角形) 改性的豌豆蛋白。在 y 轴的线上手动添加未添加酚的 PPI 凝胶
随后，凝胶暴露于大变形以研究其变形能力。计算出的临界应变（即结构破坏开始的应变）如图 6A 和 B 所示。当材料在某个宏观平面上结构元素之间的所有键断裂时，就会发生结构破坏。这最终会导致材料崩解，因为结构的破坏发生在比结构元素本身更大的长度尺度上。在图 6A 中，临界应变被描绘为添加的苯酚浓度（mM）的函数。在图 6B 中，临界应变被绘制为基于质量（g/L）的添加的苯酚浓度的函数。此外，还构建了弹性李萨如曲线，以进一步揭示添加苯酚对凝胶结构破坏模式的影响（图 7C）。除了分解模式之外，还可以计算耗散比 (φ) 来总结整体基本非线性行为。当 φ = 0 时，流变响应纯弹性，而 φ = 1 表示材料表现出完美的塑性行为。当 φ = π/4 ≈ 0.785 时，我们称之为纯粘性或牛顿流体。耗散比值显示在热图中以供比较（图 6D）。![]()
图6 未用酚类物质改性的 15 wt% PPI 凝胶（参考文献 [REF]，黑色）、用没食子酸（GA，绿色/点）、表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG，橙色/正方形) 和单宁酸 (TA，棕色/三角形) 改性的 15 wt% PPI 凝胶的大振荡剪切测量。建立临界应变与添加的酚类物质浓度 (A) (mM) 和 (B) (g/L) 的关系。(C) 应力与应变幅度的弹性李萨如曲线和 (D) 耗散比 φ (-) 在五个不同的应变幅度 (1.07、11、27.9、49.9 和 89.4) 下
研究内容四：
凝胶形成效率游离氨基的减少证实了主要发生了共价修饰，但我们还发现随着酚类添加量的增加，未结合或非共价结合的酚类的浓度增加。共价连接的酚类可以增加共价交联和形成的结合物之间的额外非共价相互作用。凝胶强度的增加与添加的酚类浓度和酚类分子大小呈正相关。豌豆蛋白的修饰也观察到了类似的关系，这证实了酚类与豌豆蛋白的共价结合增加，蛋白质-酚类结合物上的游离酚羟基数量增加。当蛋白质聚集体之间的键（共价或物理）数量增加时，会形成更坚固的凝胶结构。这些发现证实了以下假设：用酚类改性后，PPI 聚集体之间的凝胶结构中确实可以形成更多的键（共价交联、疏水相互作用和氢键），并表明键密度的增加对凝胶强度具有重要意义。这种关系在质量浓度下比在摩尔浓度下更明显（图 5A 和 B），这一事实也证实了这些键密度增加的重要性。在相似的摩尔浓度下，较小的酚类比较大的酚类拥有更少的自由羟基，而在相同的质量下，这几乎相等。当将凝胶强度与反应前游离酚羟基的摩尔浓度相关联时，几乎完全可互换的曲线证实了这一点（结果未显示）。在这里，分子酚浓度根据氧化前分子上的羟基数量进行校正。与 PPI 参比凝胶相比，高度改性的 4 mM PPI-TA 结合凝胶中自由结合位点的减少可能与蛋白质聚集链的更密集堆积有关（图 4）。然而，自由结合位点的减少不能直接与酚类物质与豌豆蛋白的交联有关，因为非还原条件下的 SDS-PAGE 结果只能表明少量额外的蛋白质聚集。由于 PPI-酚类结合物的溶解度降低，比较尤其困难。因此，可能低估了酚类物质在凝胶结构中的共价交联作用。然而，PPI-酚类结合物的溶解度降低确实表明疏水性增加，这也可以对凝胶强度产生积极影响。
另外还测试了是否可以仅通过酚类物质与豌豆蛋白的共价或非共价连接来证明凝胶强度的大幅增加。在方案 1 中，TA 未经过碱处理，直接添加到 pH 为 7 的超纯水中的 15 wt% PPI 参考分散体中，这通常是为了诱导非共价相互作用。在方案 2 中，在碱处理下氧化。然后以粉末形式添加到 pH 为 7 的超纯水中的 15 wt% PPI 参考分散体中。随后对样品进行热处理并记录凝胶特性。
研究内容五：
大变形用酚类物质对豌豆蛋白进行改性，对凝胶变形性的影响与对凝胶强度的影响相同，其中 EGCG 的添加量高达 2 mM，TA 的添加量高达 0.8 mM（图 6A）。共价键、氢键和疏水相互作用的密度增加，使得能量在变形较大时得以耗散，同时保持完整。Balange 和 Benjakul在鱼糜蛋白-酚类凝胶系统中也发现了类似的关系，改性后，尤其是使用较大酚类物质时，凝胶强度和变形性均有所增加。然而，在 EGCG 的最佳浓度为 2 mM 和 TA 的最佳浓度为 0.8 mM（图 6A）之后，由于共价键、氢键和/或疏水相互作用的密度增加，PPI聚集体之间的相互作用非常强，以至于在施加较大变形时，如果不破坏键，能量就无法耗散，这使得凝胶结构更脆。此外，随着豌豆蛋白改性程度的提高，PPI-酚类复合物的溶解性也随之提高。交联引起的大量额外蛋白质聚集也可能导致凝胶结构不均匀，甚至可溶性成分和不溶性蛋白质聚集体之间出现局部相分离。这些不溶性蛋白质聚集体随后可能充当非活性填料，并在形成“断裂点”时削弱凝胶结构。因此，增加豌豆蛋白改性程度最初可以产生更坚韧的蛋白质凝胶结构（更硬且更耐变形），但超过最佳添加的酚类分子浓度会导致凝胶结构更脆。凝胶在高应变变形时粘性行为的增加证实了这一点（图 6D）。非共价结合的酚类物质的存在很可能导致了局部相分离，在高改性程度下，EGCG 和 TA 制成的复合物中非共价结合的酚类物质含量最高。尽管这种影响规模很小，无法用共聚焦激光扫描显微镜进行可视化（图 4）。与凝胶强度类似，将可变形性与每个酚分子的 OH 基团数量相关联（未显示结果）会导致与图 6B中所示的响应几乎相同。这证实了所选酚在氧化前的分子结构对胶凝特性的重要性。因此，似乎需要考虑的主要因素是氧化前游离酚羟基的总数。这意味着当使用相同质量时，选择小或大的酚类化合物并不重要。胶凝特性和酚类质量之间的明确关系也允许对使用最佳酚类浓度提出更具体的建议。在这里，高达 1.36 g/L（相当于蛋白质质量的 3.8 wt%）可以产生更硬且更易变形的凝胶结构。这在豌豆中天然存在的总酚浓度范围内。研究内容六：
将实验结果放在背景中
为了正确看待结果，表 3 概述了第 1 部分中提到的使用替代方法增加植物蛋白凝胶强度（例如酶交联或使用添加剂）的研究。将最大凝胶强度，即在冷却后温度扫描结束时获得的最大凝胶强度（图 5）的 G' 与其他研究中获得的最大凝胶强度进行了比较。
对于我们用 15 wt% PPI-酚类共轭物分散体（即以 PPI 测量的蛋白质含量为 11 wt% 的蛋白质）制备的凝胶，添加 4 mM TA 后相对凝胶强度最多可增加 16 倍。这远远高于 Sun 和 Arntfield（2011 年）研究中 10.5 wt% 大豆蛋白酶促交联后制备的凝胶结构的最大相对增加值，也高于 Uruakpa 和 Arntfield研究中用 κ-卡拉胶强化的油菜蛋白凝胶的最大相对增加值。只有用 κ-卡拉胶强化大豆蛋白凝胶才能使凝胶强度的最大相对增加值大于本研究中豌豆蛋白改性后获得的凝胶强度增加值。因此，与其他方法相比，用酚类物质进行改性可以得到相同（如果不是更好）的凝胶强度增加效果，并且可以缩小传统上被称为优质胶凝剂的蛋白质源（如大豆蛋白）之间的差距（第 1 部分）。
在 PPI 中添加酚类物质会导致棕色，这可能不适合某些应用。豌豆蛋白上的游离氨基作为酚类物质的结合位点，主要来自必需氨基酸赖氨酸。将酚类物质共价连接到这些基团可能会降低其生物利用度和营养价值。此外，天然存在于植物来源（如油菜）中的酚类物质被认为是苦味化合物。另一个缺点可能是由于高 pH 值下的蛋白质氧化而可能形成赖氨酸丙氨酸。因此，在未来的研究中，应研究在较温和的 pH 水平下进行结合或使用多酚氧化酶等酶。此外，工业应用需要进行升级，这被认为对结合过程是可行的。建议使用膜去除未反应的酚类物质以进行放大。Jia、Rodriguez-Alonso、Bianeis、Keppler 和 van der Goot也研究了未反应的酚类物质的去除。将纯化的酚类物质添加到纯化的蛋白分离物中成本很高。一旦确定了植物蛋白-酚类物质结合的知识，就可以通过在未纯化的植物蛋白粉中诱导结合来降低成本，因为其中已经固有存在酚类物质。本研究的主要重点是通过使用酚类物质进行改性来提高商业豌豆蛋白的功能化。因此，共价豌豆蛋白改性的主要缺点是潜在的颜色变化、蛋白质营养价值的降低和苦味。但是，可以选择适度的改性，导致颜色轻微变化，并且仅部分损失必需氨基酸的营养价值，同时仍获得凝胶强度和可变形性。
用酚类化合物对商业豌豆蛋白进行碱性修饰已被证明是一种改变豌豆蛋白胶凝特性的有效方法。酚的质量浓度和游离酚羟基的浓度与凝胶强度和可变形性的增加有关。在 4 mM 时凝胶强度明显增加。在添加 1.36 g/L 酚类化合物时，可变形性显示出最佳的修饰。这项研究表明，蛋白质-酚结合可以作为一种工具，以针对特定的凝胶强度和/或可变形性。它提供了对胶凝行为增益和营养损失之间的权衡的见解，并显示出使用精制程度较低的蛋白质级分（其中酚类化合物已经天然存在）的前景。
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