从细菌组氨酸激酶单一结构域衍生的ATP“合酶”

An ATP “Synthase” Derived from a Single Structural Domain of Bacterial Histidine Kinase

研究背景

ATP通常被称为“生命的能量货币”，因为它具有两个高能量的磷酸键，并且对于生物体的生存，代谢和信号转导等生物过程至关重要。体内ATP的合成依赖于一种叫做ATP合酶的蛋白质复合物，ATP/ADP/AMP的相对水平由腺苷酸激酶(AdK)调节。细菌的质膜、线粒体的嵴和内膜以及叶绿体的类囊体膜中都存在ATP合酶。它依靠质子（或Na⁺/K⁺）跨膜梯度从ADP和Pi合成ATP。通常，它具有多个分子量超过500 kDa的同工异构体。人类ATP合酶的结构是最近才确定的。AdK酶至少包含三个结构域，可以催化ATP水解为ADP和AMP，也可以将ADP反向转化为ATP和AMP。酶的活性和产物浓度受到不同结构域之间打开和关闭开关的构象动力学的严格调节。虽然已经成功建立了几种体外合成ATP的方法，如由多蛋白系统重建的人工细胞器和涉及12种酶的无NAD(P)/ Coa再生系统，但这些系统难以操作。因此，通过一个简单的系统在体外实现ATP的生物合成是一个重大挑战。此外，许多生物化学研究依赖于ATP的合成和消耗，因此设计一种简单的生化工具来实现生物系统中ATP的可循环能量供应是很重要的。

研究摘要

研究内容

本研究选择来自Thermotoga maritima的HK853细胞质部分(HK853^cp)作为具有代表性的组氨酸激酶。当使用ADP作为底物时，发现HK853^cp除了具有ATP水解酶功能外，还具有ATP“合酶”功能。这是TCS组氨酸激酶超家族中从未报道过的新功能。为研究“合酶”的功能，设计一种只能表达HK853的CA结构域(319-489)的质粒(HK853^CA)，纯化过程在该团队之前的工作中有描述。该蛋白在大肠杆菌中表达良好纯化后的产率约为20mg /L。HK853^CA在293 K-369 K的宽温度范围内表现出显著的稳定性。将0.01 mM的HK853^CA加入到pH为6.0的4.5 mM ADP溶液中，该蛋白能够催化ADP合成ATP。如图1D的³¹P核磁共振波谱看出，在反应过程中有明显的ATP生成，与ADP消耗的化学计量比为1:2，反应达到平衡后，超过一半的ADP转化为ATP和AMP。当0.01 mM的HK853^CA加入到4.5 mM的ADP中，温度为298 K，pH为6.0时，ATP的最终产率为1.3 mM。

研究内容二：影响HK853^CA酶催化反应的因素

如图2A，在ADP固定浓度为4.5 mM的条件下，用不同浓度的HK853^CA催化ATP合成，研究发现酶浓度越高，反应达到平衡越快，但平衡点保持不变，k_cat值也大致具有可比性。从这些数据中提取反应速率V₀和V_m，并对它们进行拟合，得到K_m为5.68 ~ 1.02 mM。在288 ~ 313 K范围内，随着温度的升高，反应速率加快（图2B）。最高温度和最低温度的k_cat值之间有一个数量级的差异。酶与底物之间的亲和力以及溶液环境的pH值也会影响酶促反应。使用等温量热法(ITC)分别测量了HK853^CA在pH 6.0和pH8.0下与惰性ADP类似物(AMPCP)和ATP类似物(AMPPCP)相互作用的热力学参数（表1）。结果表明，HK853^CA与ATP类似物的亲和性高于ADP类似物，且受pH的影响更大。pH从6.0变化到8.0时，HK853^CA与ATP类似物的亲和性增加1.6倍，而在不同pH下，HK853^CA与ADP类似物的亲和性相当。进一步比较不同pH条件下ATP合成的表观速率（图2C），发现在6.0-8.0范围内，pH越低，ATP合成速率越快，即与ITC的结果一致。此外，还探讨了金属离子对催化反应的影响，从图2D看出，在多种二价金属离子浓度相同的情况下，反应速率不同，其中镁离子存在时的反应速率要快于钙离子或锌离子存在时的反应速率。EDTA与体系中的金属离子螯合，使酶促反应完全猝灭。因此，研究结果表明，HK853CA对ATP合成的催化速率受酶浓度、反应温度和溶液pH的显著影响，而二价金属离子的存在是ATP合成的必要因素。

图2 影响HK853^CA催化ATP合成酶活性的因素。A)酶浓度对ADP合成ATP的影响。B) pH 6.0时温度对HK853^CA催化ATP合成的影响。C)pH对HK853^CA在298 K下催化ADP合成ATP的影响。D)二价金属离子是重要的催化辅助因子。

在能量上，两个ADP分子形成一个ATP和AMP分子是可行的。因此，该反应机制留下了以下三种可能性:(1) HK853^CA将ADP水解为AMP和磷酸，磷酸基短暂停留在蛋白质上与第二个进入的ADP形成ATP。然而，在溶液中加入不同浓度的磷酸盐，发现反应没有明显加速。(2) HK853^CA与ADP结合后形成二聚体，使两个ADP相互靠近，最终产生ATP和AMP。通过运行未变性的天然蛋白凝胶和NMR波谱滴定实验均未观察到任何稳定或短暂的二聚体。(3)一个HK853^CA分子结合两个ADP分子，类似于腺苷酸激酶，产生ATP和AMP，该反应是可逆的。为证明这一假设，将过量的AMP加入到pH为6.0的含有ATP和HK853^CA的溶液中。之前的实验表明，在pH为6.0的HK853^CA溶液中，ATP几乎不能被水解。在加入AMP后，研究发现实验中产生了显著的ADP，这表明ATP合成反应具有可逆性。这一结果与我们假设的AdK样反应机制一致。

图3 HK853^CA及其突变体的结合机制和催化活性。A) HK853^CA与ADP和Mg²⁺对接的结构图。B) HK853^CA蛋白表面电位分布（蓝色为正电位，红色为负电位）。C) PDB_4JAS表征的HK853^CA二级结构显示了参与相互作用的氨基酸残基位置。D)提出了基于MD仿真的交互网络机制。E) Mg²⁺滴定HK853^CA-AMPCP配合物的化学位移摄动。F) AMPCP滴定HK853^CA的化学位移摄动。G)突变体与野生型HK853^CA的ATP合成活性比较。

选择不同的ATP依赖系统，如激酶及其相应的底物，来测试HK853^CA的ATP合成酶功能（图4A）。将HK853^CA加入到YB-1与其激酶RSK II（核糖体S6激酶II）的混合物中，促进了反应的进展。由于HK853^CA的加入，原本难以在磷酸化反应中利用的ADP也成为了磷酸化的可用磷基源（图4B）。研究发现HK853^CA对折叠蛋白（YB-1；图4B），未折叠蛋白（α突触核蛋白），单链DNA（5 ' -OH寡脱氧核苷酸；图4C），生化小分子甘油（图4D）和胆碱。这些ATP依赖系统的促进作用来自于HK853^CA的ATP“合酶”活性。最初，以5 mM ADP为底物的甘油磷酸化反应直到加入HK853^CA才发生。在没有HK853^CA的情况下，磷酸化甘油的最终产率与以5mm ATP为底物的反应相当。引人注目的是，由于ATP的循环（图4A），加入HK853^CA后，GK催化的甘油磷酸化产量比不加入HK853^CA时相同ATP浓度下的反应增加了一倍（图4E）。研究还探索了HK853^CA作为未来细胞应用的分子工具的可能性，并成功观察到细胞裂解液中ATP浓度的增加，尽管由于复杂的相互作用，细胞内信号无法检测到。

图4 HK853^CA作为生物分子工具促进磷酸化反应。A) HK853^CA回收三磷酸腺苷。B) HK853^CA促进RSK II催化的底物蛋白YB-1的磷酸化。C) HK853^CA促进T4多核苷酸激酶(T4 PNK)催化的底物ssDNA 5 ' -OHA25 (5 '- OH - TGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTG)的磷酸化。D) HK853CA促进甘油激酶(GK)催化的底物甘油(Glc)的磷酸化。E)实时³¹P核磁共振定量监测p -甘油的浓度变化，发现HK853^CA使ATP磷酸化的转化率提高了一倍。

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