Modulation of a Loop Region in the Substrate Binding Pocket Affects the Degree of Polymerization of Bacillus subtilis Chitosanase Products
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.3c09313
研究背景
壳聚糖是一种可再生多糖，由氨基葡萄糖 （GlcN） 单元组成，通过 β-1,4-糖苷键连接。它来源于几丁质的部分脱乙酰化，几丁质在节肢动物、虾、蟹和昆虫的壳中含量丰富。壳聚糖酶（EC 1.1.1.132）是重要的糖苷酶之一，可催化壳聚糖中β-1,4-糖苷键的水解，生成具有不同聚合度（DP）的壳聚糖（COS）。COS具有抗菌、抗肿瘤、免疫等优异的生物学特性，在食品、医药、农业、化妆品等领域具有极好的应用前景。然而，这些应用在COS的工业生产方面受到限制。生物酶降解为生产COS提供了一种环保的方法。然而，COS的产率和纯度很大程度上取决于酶的催化特性。为了提高产品产量和纯度，已经克隆并进一步研究了来自不同来源的多种壳聚糖酶。基于使用 CAZY 数据库 （http://www.cazy.org/） 的序列相似性分析，壳聚糖酶主要属于糖苷水解酶 （GH） 家族 5、7、8、46、75 和 80。微生物是壳聚糖酶的主要生产者，真菌主要产生GH75家族壳聚糖酶，而细菌主要产生GH46家族壳聚糖酶。特别是，GH46壳聚糖酶已被彻底研究。本研究采用催化中心环区修饰策略改变壳聚糖酶产物的DP。将具有较高比活性和2-3水解产物DP的BsCsn46A与具有较低比活性和1-2水解产物DP的壳聚糖酶SaCsn46A进行比较，观察到BsCsn46A具有与底物隧道相邻的关键环区。随后，进行了三个突变体：一个是环区（SC）的缺失，另一个是自身环的复制（TJN），第三个突变体在环（TJA）后插入了七个额外的丙氨酸残基。通过生物信息学分析进一步研究了这些突变体，以阐明该特定环的功能。
研究摘要
蛋白质序列比对显示，BsCsn46A和SaCsn46A的相似度为32.66%。值得注意的是，与 BsCsn46A 相比，SaCsn46A 在 194-200 位点缺少 7 个氨基酸肽，这是不保守的序列（图 1）。堆叠两种蛋白质的三维结构发现，7个氨基酸位于活性中心。为了弄清楚该环区对BsCsn46A催化水解的影响，我们设计了SC、TJN和TJA三种突变体。BsCsn46A及其突变体由大肠杆菌BL21（DE3）表达。通过Ni-NTA亲和柱收集靶蛋白。12% SDS-PAGE结果验证了洗脱蛋白的分子量与理论相符。结果如图2A所示。
研究内容二：BsCsn46A及其突变体的分子动力学模拟结果
突变体的最佳温度为45°C，WT为55°C。因此，分子动力学模拟是在设定温度为318和328 K的情况下进行的。均方根偏差 （RMSD） 对应于酶的稳定性。(41,42)平均RMSD值越低，壳聚糖酶结构越稳定。(22,43,44)如图3所示，WT和突变体SC的平均RMSD值在318 K（WT为0.81907，SC为0.88379）和328 K（WT为0.94886，SC为0.92155）略有变化，而突变体TJN（318 K时为0.94369,328 K时为1.20056）和TJA（318 K时为0.88271,328 K时为1.1122）的平均RMSD值变化显著。从图3可以看出，TJN和TJA在318 K时的RMSD值低于328 K时的RMSD值，符合最佳温度研究。
图3 WT、SC、TJN和 TJA 在 328 K （a） 和318 K （b） 时的 RMSD。WT、SC、TJN和 TJA 的 RMSF 为328 K （c） 和 318 K （d）。
撰稿：张 杰
校稿：曹少攀
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