Metal-free nitrogen-doped carbon nanodots as an artificial nanozyme for
enhanced antibacterial activity
DOI：10.1016/j.jclepro.2023.137337杂志：Journal
of Cleaner Production文章链接：https://doi.org/10.1016/j.jclepro.2023.137337
细菌引起的感染性疾病已成为对人类健康最重要的威胁之一，每年造成1000多万人死亡。浮游细菌分泌和产生的胞外聚合物质(EPS)使细菌以各种方式相互粘附，形成难以根除的细菌生物膜，可以作为抵抗宿主免疫反应和一些常规抗菌药物的屏障。细菌生物膜表现出多样性的表型变化，并对许多现有抗生素产生耐药性，导致耐药细菌的出现。耐药菌增加了临床抗感染治疗的难度，主要是由于其不良反应、结果不确定、治疗时间长、费用高。更糟糕的是，由于耐药细菌的流行、各国严格的监管程序以及低市场回报，新抗生素的开发几乎陷入停滞。纳米科学和纳米技术的最新进展催生了许多有前途的抗菌治疗方法，可以有效地控制和治疗病原微生物。与传统抗生素(小有机分子)相比，抗菌纳米材料具有良好的可回收性或生物降解性，抑制外排泵的能力，以及多种抗菌作用的潜力，可以逃避现有的耐药机制，可能不容易受到耐药选择的影响。同样，纳米技术作为传统抗菌疗法的一个有吸引力的替代方案，为丰富细菌感染的治疗策略提供了一个有前途的工具包。
天然酶可以通过在宿主防御中催化活性氧(ROS)的产生来杀死细菌，从而破坏细菌膜并使蛋白质失活。然而，天然酶也存在着稳定性低、成本高、储存困难、催化反应条件苛刻等不可忽视的缺点。幸运的是，由于纳米材料独特的物理化学性质，纳米酶可以很好地克服这些缺点。此外，研究人员还研究了各种策略来增强纳米酶的催化活性，如调整比表面积、形成杂交体和施加外部刺激。最近，多种纳米酶已被报道，包括金属纳米颗粒（MNPs）、金属有机框架（MOFs）、碳基纳米材料等，并对耐药菌株表现出突出的广谱抗菌效果。
碳基纳米酶因其低毒性和对环境的长期安全性在细菌感染的治疗中引起了广泛的关注。碳纳米点(CNDs)是一类具有sp2碳结构的碳基纳米颗粒(< 10 nm)，由于其在广谱区域的吸收，最近成为一种利用光可逆调节酶活性的新策略。CNDs的光吸收覆盖了从紫外线(UV)到近红外辐射的广泛光谱区域，在许多氧化还原反应和物理过程中，CNDs作为一种外部刺激，驱动电子转移并产生活性氧(ROS)，表现出明显的光毒性。目前，基于CNDs的纳米酶作为抗菌剂的报道主要集中在设计具有酶活性的杂化纳米酶，将CNDs与其他纳米材料结合，达到抑制细菌生长的目的。Pan等成功制备了壳聚糖接枝铁掺杂碳点(CS@Fe/CDs)，具有良好的过氧化物酶样活性，可通过fenton样反应催化H2O2生成•OH，从而切割eDNA，消除细菌生物膜。通过整合识别/转导CDs和铂纳米颗粒(PtNPs)，Liang等设计了一种精致的CDs@PtNPs (CPP)纳米耀斑，不仅在富含H2O2的酸性感染部位表现出高效的体内抗菌性能，而且在去除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的生物膜方面也表现出显著的治疗效果。然而，多组分复合材料的合成工艺复杂，收率低。此外，发挥纳米酶作用的金属复合材料可能与金属的浸出行为有关，在实际应用中难以保证环境安全。据报道，很少有单金属和无金属CNDs具有酶活性和抑制细菌生长。
本文以茶多酚和乙二胺为原料，创新制备了具有优异酶活性和抗菌性能的无金属氮掺杂碳纳米点(N-CNDs)(方案1)。N-CNDs在特定光源的激发下表现出优异的催化活性，可以模拟氧化酶的催化行为，将3,3'，5,5' -四甲基联苯胺(TMB)氧化为蓝色氧化TMB
(ox-TMB)。N-CNDs的催化过程由氧活化产生的超氧自由基(•O2-)介导，最大反应速率(Vmax)为1.59 μM⋅s-1,Michaelis常数(Km)为0.421 mM。此外，N-CNDs继承了茶多酚固有的抗菌特性，并结合光驱动酶样活化，对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有显著的抑制作用。以及革兰氏阴性大肠杆菌(大肠杆菌)和奇异变形杆菌。更有趣的是，N-CNDs独特的氧化酶模拟活性可以有效地增强其固有的抗菌性能，显示出作为一种有前景的抗菌剂的巨大潜力。
由于抗生素耐药性的出现，细菌感染已成为公共卫生的一个相当大的障碍。在此，我们合理地开发了一种新颖而有吸引力的氮掺杂碳纳米点(N-CNDs)作为高效的无金属人工纳米酶，通过继承茶多酚的抑菌能力和光触发氧化酶的催化活性来协同有效地抑制细菌的存活。N-CNDs在光下表现出优异的模拟氧化酶活性，其最大反应速率(1.59 μM⋅s-1)高，Michaelis常数低(0.421 mM)，由超氧自由基(•O2-)介导。此外，构建的基于N-CNDs的纳米酶被证明可以作为一种复杂的生物材料平台，通过光驱动氧分子生成•O2-来进行有效的杀菌。值得注意的是，N-CNDs固有的抗菌能力可以有效地抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，特别是对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度(MIC90)为375 μg⋅mL-1。N-CNDs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭活率分别为59.72%和37.15%。而N-CNDs在光照下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭活率分别高达97.91%和80.02%。令人鼓舞的是，双向方差分析显示，N-CNDs浓度和光照时间对抗菌行为具有协同效应，这为持续清除暴露细菌提供了有利条件。这种基于新型无金属碳基纳米酶的细菌协同清除策略为食品安全和环境保护中的细菌污染管理提供了一种强大而可行的方法。
以茶多酚和乙二胺为原料，采用经典、简便的一步水热法制备了无金属N-CNDs。从图1a的TEM图像可以看出，N-CNDs的粒径范围为1.50 ~ 5.50 nm，符合正态分布曲线，平均粒径约为3.40 nm(图1b)。图1a中插入的代表性HRTEM图像显示，N-CNDs的晶格间距约为0.22 nm，与石墨烯(100)平面相同。进一步应用N-CNDs的AFM图像(图1c)来说明地形形态，证实N-CNDs具有均匀分布，平均高度为4.30 nm(图1d)。TEM和AFM分析结果表明，N-CNDs基本呈球状结构。如图S1所示，N-CNDs的XRD谱图在23◦处显示出一个宽的2θ峰，这与石墨晶格间距(002)有关，归因于sp2-杂化非晶碳。这些结果表明，N-CNDs具有高度无序的碳原子和球状石墨化结构。
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图1 (a) TEM图像(插图:放大HRTEM图像)，(b)尺寸分布，(c)AFM图像，(d)高度分布，(e)XPS调查扫描，高分辨率(f)N 1s，(g)C 1s，(h)O 1s XPS光谱，(i)N- CNDs的FT-IR光谱。
利用XPS和FT-IR分析表征了N-CNDs元素的化学状态和表面组成。XPS扫描图(图1e)显示，N-CNDS主要由C、N和O元素组成，分别对应C1s (286.8 eV)、N1s (402.8 eV)和O1s (531.8 eV)(图1d)。元素分析测得的C、H、N和O的重量百分比分别为34.52 wt%、6.53 wt%、18.22 wt%和40.73 wt%(表S1a)，相应的N-CND的经验公式约为C2H5NO2(表S1b)。C1s的XPS谱(图1g)可以解卷积成284.7、285.8和288.0 eV的三个峰，分别归属于C-C/C=C、C-N/C-O和C=O。此外，O1s光谱包含531.1、532.2和535.2 eV三个峰，分别对应C=O、C-O和O-C=O(图1)。XPS结果表明，N-CNDs表面存在丰富的-NH2、-OH、-COOH等亲水基团，保证了N-CNDs具有良好的水分散性，FT-IR光谱结果也证实了这一点。在FT-IR光谱(图1i)中，N-CNDs在约3100-3700 cm-1处显示出一个特征宽而尖锐的峰，表明其表面存在羟基和氨基官能团。1577、1491、1336和1160 cm-1处的峰分别对应于C-C、-NO2、C-N和C-O的拉伸振动。这些结果与XPS基本一致。进一步研究了N-CNDs的光学性能。制备的N-CNDs在激发波长为394 nm时表现出明亮的蓝色荧光，发射波长为463 nm(图S2a)，而CNDs的最佳激发和发射波长分别为360 nm和438 nm(图S2b)，说明氮掺杂导致N-CNDs的荧光光谱发生了明显的红移。这种红移可能源于N-CNDs中HOMO-LUMO间隙的缩小，这主要归因于N-CNDs中石墨氮结构的存在。N-CNDs(图S2c)和CNDs(图S2d)都具有与先前报道的激发波长依赖行为相似的特征，即当激发波长从280 nm变为480 nm时，发射波长从430 nm变为505 nm，这可能是由于存在能量不同的发射陷阱。此外，我们还详细研究了N-CNDs和CNDs的紫外-可见吸收光谱(图S3)。CNDs在240 nm处有一个典型的尖吸收峰，对应于石墨sp2畴的π→π*跃迁，而n -CNDs在302 nm处有一个宽吸收峰，对应于C-N的n→π*吸收带。氮原子掺杂后，N-CNDs的特征吸收峰发生了明显的红移，这可能是由于石墨氮的电子掺杂效应显著改变了N-CNDs的电子能级，导致N-CNDs的吸收光谱发生了红移。研究了N-CNDs和CNDs在不同环境下的荧光稳定性。连续365 nm紫外照射180 min(图S4a和图S4b)或连续氙灯照射5400 s后，N-CNDs和CNDs的光致发光(PL)强度几乎没有衰减。此外，N-CNDs和CNDs在不同pH溶液(图S5a和图S5b)和高浓度KCl溶液(图S5c和图S5d)中均保持相对稳定的PL强度。这些结果表明，N-CNDs和CNDs具有不同的光学性质，但都具有优异的荧光稳定性。研究内容二：N-CNDs类氧化酶模拟活性
出乎意料的是，我们发现以TMB为典型底物制备的N-CNDs在光激发下表现出半模拟氧化活性。如图2a所示，在负载365 nm滤光片(20
mW·cm-2)的500 W汞氙灯照射下，N-CNDs可以催化TMB快速氧化生成蓝色产物，在652 nm处具有很强的特征吸光度。与天然氧化酶类似，缓冲液的pH、酶的剂量和光照时间都可能影响N-CNDs的氧化酶模拟活性。由图2b可知，在pH为3.5时，ox-TMB在652nm处吸光度最大，因此后续所有实验均选择3.5作为最优pH。TMB氧化产生的蓝色物质在652nm处的吸光度随着N-CNDs剂量的增加而增加(图2c)，表明N-CNDs对TMB的氧化是剂量依赖性的。最后，综合考虑检测灵敏度和分析速度，确定最佳条件为100 μg⋅mL-1 N-CNDs、80 μM TMB、pH = 3.5。如图2d所示，在特定光源的开关交替照射下，N-CNDs表现出逐步模拟氧化酶的活性，证明了它们的光控催化活性。光控催化活性可能是由于氮原子增强了电子电荷转移和纳米颗粒的比表面积，从而提供了催化活性位点。可以观察到，N-CNDs作为模拟氧化酶的动力学在测试浓度范围内符合典型的Michaelis-Menten方程（图2e）。根据Michaelis-Menten动力学方程建立Lineweaver-Burk模型，得到pH = 3.5时酶动力学特征参数Km和Vmax分别为0.421 mM和1.59 μM⋅s-1(图2f)。当酶促反应达到Vmax的一半时，Km = [S]，说明Km值越小，达到最大速度所需的底物越少，酶与底物的亲和力越大。此外，我们将这项工作的动力学特征参数与其他类型的碳纳米点纳米酶进行了比较(表1)。大多数报道的碳纳米点纳米酶具有过氧化物酶样活性，这主要依赖于碳纳米点刺激ROS产生H2O2。与具有类似于光驱动氧化酶活性的基于碳纳米点的纳米酶TA-NCDs相比，N-CNDs具有更好的动力学常数Vmax和Km，并表现出优异的催化性能。![]()
图2 N-CNDs的光活化氧化酶样活性。(a) N-CNDs (100 μg⋅mL-1)和TMB溶液(80 μM)在pH 3.5不同条件下处理后的紫外-可见吸收光谱。(b) N-CNDs在不同pH溶液中的紫外-可见吸收光谱。(c) N-CNDs浓度对模拟氧化酶活性的影响。(d)特定光源连续开启(红箭头)和关闭(绿箭头)时N-CNDs催化能力的阶梯状行为。(e)光照射(pH = 3.5)下N-CNDs的稳态动力学分析。(f)用于计算酶动力学参数的N-CNDs的Lineweaver-Burk图。每个误差条表示三个独立测量的标准差。
研究N-CNDs的抗氧化活性机理对于进一步研究类酶碳纳米点具有重要意义。对于N-CNDs的氧化酶模拟活性，可能涉及一些活性氧(ROS)，包括超氧阴离子(•O2-)，羟基(•OH)，氧空位和单线态氧(1O2)。为了探索N-CNDs的催化机理，我们选择EDTA•2Na、IPA、BQ和Try分别用于清除氧空位、•OH、•O2-和1O2。在图3a中，只有在加入BQ后，652 nm处的吸光度才几乎完全被抑制，这表明溶解氧可能与N-CNDs反应生成• O2-，这在模拟氧化酶的催化体系中起着关键作用。此外，利用电化学循环伏安法检测N-CNDs的氧化还原电位(图S6)，表明N-CNDs几乎没有氧化还原峰，只有一个氧化还原电位。因此，氧化还原电位不适合评估N-CNDs是否能产生• O2-。然而，ESR被认为是检测•O2-最广泛使用和最令人信服的方法。因此，我们使用ESR来确认使用DMPO作为•O2-敏感的捕集剂可以产生短寿命的•O2-。DMPO可以在甲醇溶液中捕获•O2-生成DMPO-• O2-化合物，并在四线光谱中表现出独特的ESR信号，其相对峰模式为1:1:1:1。如图3b所示，在没有特定光源的情况下，N-CNDs中的纯DMPO是ESR沉默的(黑线)，而在特定光源存在的情况下，在ESR光谱中可以清楚地识别出独特的• O2-(红线)峰，进一步表明•O2-是N-CNDs产生的主要自由基类型。为了充分说明光控N-CNDs对•O2-生成的催化活性机理，研究了光照射下N-CNDs和CNDs对TMB的催化作用。在相同的实验条件下，CNDs并没有表现出与N-CNDs相同的模拟氧化酶活性(图S7)，这表明N-CNDs的模拟酶活性来源于氮的引入，这与许多报道的研究相似，即硝基氮和石墨氮进入碳骨架可以改善CNDs的内部结构，调节电子能级，从而增强N-CNDs的催化活性。综上所述，我们认为N-CNDs介导的TMB氧化反应的机理是N-CNDs在特定光源下催化氧分子生成的•O2-与TMB反应生成ox-TMB。![]()
图3 (a)在PBS缓冲溶液(0.2 M, pH = 3.5)中，特定光源(20 mW⋅cm-1)照射10 min，几种清除剂对N-CNDs氧化TMB的影响。(b)特定光源(20 mW⋅cm-1)在甲醇中照射15 min时，DMPO + N-CNDs体系的ESR光谱。
研究内容四：N-CNDs的抗菌活性
由于茶多酚有抑制细菌生长的报道，我们推测N-CNDs可能继承了茶多酚的这一特性，并在抗菌领域发挥作用。因此，以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S. aureus)和枯草芽孢杆菌(B. subtilis)以及革兰氏阴性菌大肠杆菌(E. coli)和奇异变形杆菌(P. vulgaris)为模型微生物，对N-CNDs的抗菌性能进行了研究。在相同条件下，用不同浓度(0、75、150、225、300、375 μg⋅mL-1)的N-CNDs孵育相同量的菌悬液10 h，比较菌悬液的OD600值，评价细菌的生存能力。可以观察到，随着N-CNDs浓度从0 μg⋅mL-1增加到375 μg⋅mL-1,N-CNDs对4种细菌的生长抑制作用逐渐增强(图4a-d)。当N-CNDs浓度达到375 μg⋅mL-1时，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和普通假单胞菌的细菌活力分别降至9.89%(图4e)、55.83%(图4f)、58.22%(图4g)和49.75%(图4h)，对应的抑菌率分别为90.11%、44.17%、41.78%和50.25%。结果表明，N-CNDs对金黄色葡萄球菌的MIC90值为375 μg⋅mL-1，对寻常假单胞菌的MIC50值为375 μg⋅mL-1，抑菌活性较弱。更重要的是，N-CNDs在室温下放置3个月后，对金黄色葡萄球菌仍有良好的抗菌活性。从表S2中我们可以发现，N-CNDs的抗菌活性与已有报道的其他材料相当，该研究预测N-CNDs是一种具有极有前景的抗菌纳米材料。![]()
图4 (a)金黄色葡萄球菌、(b)枯草芽孢杆菌、(c)大肠杆菌和(d)寻常假单胞菌在不同浓度N-CNDs(0、75、150、225、300和375μg⋅mL-1)处理下的生长曲线。(e)金黄色葡萄球菌、(f)枯草芽孢杆菌、(g)大肠杆菌和(h)寻常假单胞菌在不同浓度N-CNDs(0、75、150、225、300和375μg⋅mL-1)培养下的细菌活力。
为了确定N-CNDs的抑菌性能是否完全来源于茶多酚的抑菌能力，我们将茶多酚(500 μg⋅mL-1)置于细菌悬浮液中12 h，用平板计数法计数菌落数。结果表明，茶多酚对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌活性(92.3%)，但对大肠杆菌的抗菌活性较弱(31.1%)(图5a和图S8)。更重要的是，N-CNDs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用明显强于茶多酚，这表明茶多酚在组装和碳化形成N-CNDs的过程中，不仅完全保留了茶多酚本身的抑菌特性，而且具有比茶多酚更强的抑菌能力。利用常规分析方法扫描电镜(SEM)直观地检测了N-CNDs处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌膜破坏情况。如图5b所示，对照组金黄色葡萄球菌细胞和大肠杆菌细胞的细胞壁规则、光滑，而N-CNDs作用3小时后，大肠杆菌细胞壁出现轻微收缩、变形、塌陷，部分金黄色葡萄球菌细胞壁完全破裂、破裂。总之，N-CNDs不仅继承了茶多酚的抗菌特性，而且在炭化过程中进一步增强了抗菌效果，最终通过破坏细菌的细胞壁抑制细菌的生长。![]()
图5 (a)用相同浓度的茶多酚和N-CNDs (500 μg⋅mL-1)处理12小时后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌图像。(b)用N-CNDs (24 μg⋅mL-1)处理3小时后的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的SEM图像。
由于N-CNDs本身的抗菌作用相对较弱，在实际应用中存在局限性，我们进一步探索N-CNDs的模拟氧化酶活性是否可以增强其自身的抗菌行为。首先，通过AO/PI共染色检测未处理、N-CNDs处理和NCNDs+光处理细菌的活/死细菌活力。借助共聚焦荧光显微镜成像分析，直观地显示了活菌和死菌的分布。染色后，活菌显示绿色荧光信号，而死菌由于膜损伤显示红色荧光信号。与对照组较强的绿色荧光信号相比，N-CNDs处理组和N-CNDs +光处理组的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表现出更多的红色荧光。此外，N-CNDs +光处理组的红色荧光信号明显强于N-CNDs处理组，而绿色荧光信号几乎消失(图6a)。这些结果进一步证实了光可以提高N-CNDs的抗菌效率。随后，为了更好地探索N-CNDs在体外的抑菌能力与光照时间的关系，我们将菌悬液与N-CNDs溶液孵育3小时，然后进行不同光照时间的孵育，用平板法进行计数(图6b和c)。从图6d和e可以看出，在不含N-CNDs的情况下，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在光照60 min后的存活率为97.5%。这表明光线对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生存能力几乎没有影响。在没有光照的情况下，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌存活率随着N-CNDs浓度的增加而逐渐降低，这与之前的实验结果一致。随着N-CNDs浓度的增加，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的存活率相应降低，这与以往的研究结果一致。光照射60 min后，9.6 μg⋅mL-1的N-CNDs分别能灭活98.01%的大肠杆菌和81.12%的金黄色葡萄球菌。对于大肠杆菌，当N-CNDs浓度达到14.4 μg⋅mL-1时，光照60 min后，固体琼脂板上几乎没有菌落。此外，双向方差分析显示，N-CNDs浓度(p < 0.001)和光照时间(p < 0.01)对细菌活力都有显著的负影响(表2)。同时，N-CNDs浓度和光照时间对细菌活力有交互作用(p < 0.05，表2)，表明N-CNDs浓度和光照时间对抗菌活性有协同作用，这一结论适用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。综上所述，将N-CNDs对细菌膜的破坏行为与N-CNDs光照射产生ROS相结合，可以加速细菌死亡并提高抗菌效率(图7)，说明N-CNDs在体内治疗细菌感染或抑制环境中的细菌方面具有相当大的潜力。![]()
图6 (a) N-CNDs处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的荧光显微镜图像，AO和PI染色(比例尺:100 μm)。不同浓度N-CNDs和不同光照时间对(b和c)大肠杆菌和(d和e)金黄色葡萄球菌菌落形成的影响(b)和(d)中的红框表示不同浓度的N-CNDs在无光条件下对细菌生长的抑制作用。
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图7 N-CNDs在(a)正常和(b)光照条件下的抗菌机制。
综上所述，我们制备了低成本、生物相容性和水分散性的无金属N-CNDs，具有模拟氧化酶的活性，其自身的抗菌活性可以通过光驱动增强，具有良好的抗菌活性。在清除剂和ESR的帮助下，我们确定了N-CNDs的光驱动模拟氧化酶活性是由N-CNDs的氧活化产生的•O2-介导的。N-CNDs颗粒小，具有丰富的吡咯氮活性位点，可导致细胞膜完整性丧失和细胞膜破裂，可有效地用于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。•O2-自由基的光驱动生成已被证明是负责光催化杀菌的活性氧，它可以与N-CNDs固有的抗菌活性协同，显著提高抗菌效果，实现更高效的杀菌。综上所述，N-CNDs作为一种低成本的无金属碳基纳米酶，有望在消毒、灭菌、环境修复和其他伤口愈合应用中成为一种极有前途的材料。
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