A synthetic methylotrophic Escherichia coli as a chassis for bioproduction from methanol
研究背景
为了克服这些限制，在过去的十年里，人们花费了很大的努力将大肠杆菌转化为合成的亚甲基营养素，以及其他经常用于工业应用的模型生物。大肠杆菌中的工程项目受益于一个横跨学术界和工业界的巨大生态系统。此外，在许多商业发酵过程中，大肠杆菌已被证明是一个可行的生物技术主力。赋予大肠杆菌额外的在甲醇上生长的能力，将使绿色甲醇的使用成为可能，从而使温室气体对生物制品产生价态作用。
最近，Kim和他的同事报道了一株大肠杆菌菌株通过还原甘氨酸途径(Double Time(Td) ≈ 54 h)在甲醇上生长。我们和其他同事在大肠杆菌中设计和进化了高效的核酮糖一磷酸(Rump)循环(图1A)，这导致菌株在大约8 h的倍增时间内生长。然而，这些合成的甲基营养素用于甲醇生物生产的工程尚未展示。
在这里，我们建立了合成甲基营养物质作为一种新的甲醇生物生产模式。我们首先改进了甲醇的生长，获得了4.3 h的倍增时间。这比自然模型甲醇芽孢杆菌(Td = 5 h)在37 °C下的速度更快。在合成的大肠杆菌菌株的基础上，我们演示了关键代谢节点的生产，这些节点是大量生物产品的起点。来自丙酮酸的乳酸、来自乙酰辅酶A的聚羟基丁酸(PHB)、来自三羧酸(TCA)循环的衣康酸和来自分支酸途径的对氨基苯甲酸(PABA)(图1B)。最后，在补料间歇式生物反应器中，合成的甲基营养菌以甲醇为原料生长到光密度(OD600)为100时，提高了衣康酸的产量，达到1 g L−1。这一研究突出了在大肠杆菌中合成甲基营养的潜力，为未来工业化转化甲醇奠定了基础。
图1 在大肠杆菌中使用合成甲基营养素进行生物生产
研究摘要
研究内容
研究内容二：MEcoli_ref_2在甲醇上快速生长的适应性
我们开始了解与最初的甲基营养种群相比，遗传和生理适应改善了MEcoli_ref_2在甲醇上的生长。已定义祖先的独立并行进化经常导致相同遗传目标中的突变固定，并负责适应度增加。因此，为了确定与改善的甲基营养生长相关的突变，我们确定了进化系列稀释液(D，1,205；E，1,130，F，1,118；G，1,119代；图2A)的元基因组组成，并确定了重复突变的基因座。平均每个重复系累积316 ± 57。与初始甲基营养相比的非同义和基因间突变(补充数据表3)。虽然在核苷酸水平上几乎没有观察到进化上的平行，但我们发现功能代谢单位甲醇氧化、臀部循环和丙酮酸代谢被反复打击。这也反映在基因和基因间区水平上，我们确定了在所有复制系中独立突变的8个基因和基因间位点(图2C，d和补充数据表3和4)。与以前的发现50-52一致，这表明这些靶点的突变是甲醇产量增长的驱动因素。
为了阐明中枢碳代谢的变化，我们在体外检测了突变的酶，并结合了硅胶模型和以前的见解中的理论考虑。甲醇氧化的目标是甲醇脱氢酶中的两个氨基酸替换的遗传改变和甲醇脱氢酶编码质粒中的几个基因间突变(Imdh；图2C)。后者可能增加了甲醇脱氢酶的表达。4个重复品系中有3个存在甲醇脱氢酶突变(品系D和E为F279I，品系G为V359E)。未发现突变的F系克隆分离物的平均生长速度比其他品系慢。为了进一步研究甲醇脱氢酶突变的影响，我们测定了初始甲基营养种群(Mdh(H165N))和MEcoli_ref_2(Mdh(H165N， F279I))中存在的甲醇脱氢酶变异体对甲醇的动力学参数。
RuMP循环的遗传元件在hps-phi操纵子(Phps-phi)的启动子区域和编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶(gnd)的基因上发生了突变。hps-phi操纵子启动子的变化可能微调了3-己酮糖6-磷酸合成酶和6-磷酸-3-己糖基异构酶的表达，这两种酶对甲醛有效地同化到残基循环中是至关重要的。保持较低的细胞内甲醛浓度是必要的，以防止有毒的蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA交联以及确保在热力学不利的甲醇脱氢酶反应中有效的甲醇氧化。6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖酸脱羧为5-磷酸核酮糖，是所谓异化残渣循环的一部分，该循环将甲醛氧化为二氧化碳，而不是产生生物质前体。在天然的甲基营养细菌中，这一途径有助于NADPH的产生和甲醛的解毒。我们预计，通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化的反应的高通量将是有害的，因为它会导致二氧化碳形式的碳当量的损失，并减少残渣循环产物丙酮酸的产生。为了证实这一概念，我们使用简约通量平衡分析(PFBA)对大肠杆菌的甲醇代谢进行了建模，这是传统通量平衡分析的一种变体，已被证明能够准确预测经历长期适应进化的大肠杆菌中的通量。对于最佳生长，pFBA预测通过6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶反应的通量很少(即，该反应从反应底物6-磷酸葡萄糖酸中带走不到总通量的10%(图2D)。消除酶的活性对预测的增长率几乎没有影响，因为NADPH的产生可以被吡啶核苷酸转氢酶(最佳增长率的99%)所补偿。相反，增加通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化的反应的通量线性地降低了预测的增长。在观察到的四个GND突变中，有两个导致了过早终止密码子，另外两个与功能丧失有关。MEcoli_ref_2中的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(GND)突变体，即GND(E282*)，在体外对6-磷酸葡萄糖酸的活性显著降低(5.5 ± 3.3%)。三个突变影响了丙酮酸结节。我们早些时候已经注意到，碳进入MEcoli_ref_1中的TCA循环是通过羧化反应进行的。这与我们的pFBA分析一致，该分析预测了碳从丙酮酸流向磷酸烯醇式丙酮酸，然后与二氧化碳缩合成草酰乙酸(图2D)。重要的是，为了避免创造无效的循环，从磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸的反向反应不能携带通量(图2D)。从丙酮酸到磷酸烯醇式丙酮酸的通量可能通过破坏磷酸烯醇式丙酮酸合成酶调节蛋白而进一步优化。编码基因ppsR被截短或获得突变，导致所有复制品系和MEColiref_2的氨基酸发生变化。磷酸烯醇式丙酮酸合成酶调节蛋白活性的丧失阻止了磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的磷酸化，从而使其失活。总体而言，1200多代的进化调整了丙酮酸的代谢，以防止ATP丢失。
除了直接影响甲醇代谢的基因变化外，另外两个基因在所有复制株系中都发生了突变，分别是rhlB和fepA。在所有系列稀释重复和MEColi_ref_2中，编码依赖于ATP的RNA解旋酶的rhlB基因发生突变或截断，表明功能丧失。该蛋白是大肠杆菌降解体的组成部分，参与RNA和核糖体的动态平衡以及调节蛋白质组组成。在分离MEColi_ref_1后，所有进化株中的rhlB突变都是固定的，可能导致了MEColi_ref_2中的蛋白质组的系统性变化。当我们比较两个MEColi_ref菌株的蛋白质丰度时，他们的蛋白质组显示出不同的组成和145个差异表达的蛋白质。为了确定适应其表达模式的细胞过程，我们进行了基因本体论(GO)基因集浓缩分析。在14个丰富的GO术语中，大多数围绕核糖体生物发生，其相关蛋白持续上调。在大肠杆菌中，生长速度与核糖体含量成正比。然而，缺乏甲醇以外的碳源会在大肠杆菌中触发严格的反应，并导致核糖体的下调。因此，通过突变rH1B来去除降解体的活性可能会提高核糖体的生物合成，从而促进生长。
图2 MEColi_ref_2的生长及其遗传适应
PHB是由AcCoA产生的，需要在大肠杆菌中异源表达三个基因(图3A)。我们从PHB天然产生菌Cupravidus Necator H16中获得了所需基因(PhaCAB)，并将其克隆到上述表达载体(pl_phb)中。在pl_phb转化为MEColi_ref_2后，phaCAB操纵子的表达导致产生约0.32 ± 0.11 mg L−1(图3C，F)。
图3 甲醇生物转化为来自四个不同代谢节点的产物
研究内容四：通过高密度培养提高产量
在经济的工业生产过程需要高细胞密度来实现高时空产量。为了证明在大肠杆菌中合成的甲基营养物质原则上适合于精密发酵，我们在生物反应器中分批补料条件下培养了MEColiref_2。按照标准的生物反应器方案，MEColiref_2以指数级增长到OD600值100.2(22.1± 0.5gCDW L−1)，倍增时间为4.9 h(图4A)。在达到生物量浓度时，氧转移变得有限。接下来，我们探索更高的生物量是否会转化为使用衣康酸产生菌株的增强性能。我们将pl_Ita转化的MEColi_ref_2培养到OD600为46，随后诱导酶表达，导致衣康酸滴度增加约7倍，1.0 g L−1(7.7 mm)，与摇瓶相比，生产率提高8倍，15.0 mg L−1 h−1(图4B，C)。重要的是，性能参数随着生物质浓度的增加而成比例增加，表明摇瓶生产可以有效地放大。总体而言，我们可以证明MEColiref_2在精确发酵条件下生长和生产附加值产品的能力。
图4 通过高密度培养提高衣康酸产量
撰稿：杨雨欣
校稿：曹少攀
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