A novel degradation mechanism of naphthenic acids by marine
Pseudoalteromonas sp.
DOI：10.1016/j.jhazmat.2021.127534杂志：Journal of Hazardous Materialshttps://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.127534
环烷酸 （NA）是用于描述主要烷基取代的脂环羧酸与少量无环脂肪族酸（沥青和其他形式的石油的天然成分）的复杂混合物的统称。随着石油工业的发展，由于勘探、采矿、运输，石油产品对水、土壤、沉积物和海洋环境的风险越来越大。由于NAs相对稳定、不挥发、半衰期长和表面活性剂特性，很容易进入陆地和水生生物体内并积累，并可能对人类健康和生态系统造成重大的潜在威胁。事实上，石油污染物可以从多种来源直接或间接进入海洋环境，包括地表径流和油砂尾矿池的自然泄漏，以及意外泄漏。迄今为止，只有少数研究报告了海洋环境中存在NAs，例如，在2010年深水地平线石油（墨西哥湾）爆炸和韩国石油泄漏事件之后，在周围水域和沉积物中检测到不同类型的NA。在我们之前的研究中，7.16漏油事故发生后，中国大连湾沉积物中NAs的丰度比总多环芳烃（PAHs）高10-30倍。然而，NAs在海洋环境中的运输、生物降解和风险仍然未知，因此，有必要扩展有关NAs在海洋生态系统中生物降解的信息。本研究从海洋沉积物中分离出一种普遍存在的兼性厌氧菌——假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp. JSTW），探索NAs的降解过程。本研究的目的是（1）探索NAs在海洋环境中的生物降解途径，（2）阐明好氧生物降解过程中的细胞反应机制。
环烷酸（NAs）是一种持久性有毒有机污染物，存在于世界各地的不同环境中，对生态系统和公众健康造成严重威胁。然而，关于NA在海洋环境中的行为和命运的知识仍然未知。本研究以常见的本地海洋假交替单胞菌为研究对象，研究了NAs（环己基乙酸，CHAA）的降解机理。结果表明，CHAA在好氧条件下可以完全降解，但在厌氧条件下不能直接利用。有趣的是，转录组和关键酶活性结果表明，在有氧条件下诱导的CHAA降解途径在厌氧条件下仍然可以起作用。在相关酶的辅助作用下，乙酰辅酶A转移酶激活降解，依次形成相应的环己烯、醇和酮，最后通过羟甲基戊二酸辅酶A裂解酶裂解。趋化性与需氧降解基因呈正相关，趋化性可增强细菌运动和NAs生物降解。提出细菌可以转移到NAs并完成从好氧环境到厌氧环境的生物降解，这是NAs厌氧降解途径的新途径。这项研究为NAs和其他有机污染物在海洋环境中的命运提供了新的见解。
研究内容一：替代NA的生物降解特性
CHCA/CHAA的好氧降解曲线如图1（a、b）所示。约90%的CHCA在48 h内降解，72 h内低于检测限，而CHAA需要168 h才能降解至90%，直到192 h才完全降解。热杀对照实验没有明显减少，表明非生物过程引起的CHCA/CHAA损失可以忽略不计。硝酸盐消耗量、亚硝酸盐和铵的形成如图1（c、d）所示。在降解过程中，硝酸盐的浓度随着CHCA/CHAA的去除而逐渐消耗，最后观察到微量的亚硝酸盐和铵。此外，系统中的TOC浓度从18.9显著降低±0.5-7.0±0.1 mg L−1和 OD600值逐渐增加，随着 OD600CHCA组高于CHAA组，表明CHCA和CHAA在有氧条件下均可降解，但CHAA的生物降解持久性高于CHCA。随着实验从好氧状态向厌氧状态的转变，90%的CHCA在约60 h内降解，84 h内完全降解。但是，没有氧气，CHAA不能直接降解，即使降解时间延长至14天，也没有观察到显着降低。有趣的是，CHAA可以在厌氧条件下被来自好氧降解组的细胞生物降解。同时，TOC浓度从17.73 mg L降至8.51 mg L−1和 OD600随着CHAA的去除而显著增加，并且没有观察到完全的反硝化途径。在好氧和厌氧降解中，硝酸盐已被证实通过异化形成铵，并根据转录组数据在CHAA降解中被细胞利用。在厌氧条件下，未观察到完全的反硝化途径，硝酸盐被还原为亚硝酸盐，随后分别通过还原酶和亚硝化酶形成铵。因此，硝酸盐最终在有氧和厌氧降解过程中充当细胞的氮源。
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图1 JSTW菌株CHCA（a）和CHAA（b）在好氧条件下的生物降解曲线。CHAA好氧降解（c）和厌氧降解（d）过程中硝酸盐、亚硝酸盐和铵的变化
研究内容二：CHAA的好氧和厌氧生物降解途径
GC-MS在好氧组和厌氧组均捕获了几种中间体，并基于光谱数据库初步确认了它们的质谱数据。由于异构体产物的存在，我们根据文献报告（图2 a-c）鉴定了几种降解产物。两个光谱图所示的质量离子的m/z值为212，比CHAA观察到的质量离子小两个质量单位，表明在CHAA降解过程中发生了脱氢和碳-碳双键形成。此外，还观察到两种不同的破碎模式，揭示了两种具有相同质量离子的典型异构体产物的形成，即1-环己烯乙酸（图2a）和环己亚乙酸（图2b）。必须注意的是，这些分子断裂之一可能优先发生在烯丙基位置，环己二烯酸的电子轰击可能导致酮基和三甲基硅烷基衍生物的O-TMS基团之间的大量分子断裂，这与先前的报道一致。环远端的烯丙基位置将导致乙酸侧链的第一个碳基和酮基团之间的高频断裂，产生具有 117 的 m/z 片段。在图2b中，最丰富的片段出现在m/z 122的位置，表明鉴定的代谢物是环己二乙酸。开环产物可以是8-羟基庚酸（图2c），产生带有143、159、174、187和197的m/z片段，它们是脂肪酸的常见片段。结果表明：CHAA开环前好氧降解和厌氧降解后，关键产物相似。基于中间产物，可以推测，在好氧和厌氧降解中，CHAA经脱氢步骤转化为1-环己烯羧酸和环己亚乙酸，然后经水解氧化生成相应的醇类和酮类，最后打开环生成脂肪酸。与报告类似，Arthrobactersp. CA1可以将CHAA转化为环己二烯乙酸，并且在CA1菌株降解CHAA的过程中形成了内酯中间体。
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图2 CHAA生物降解中间体的频谱图（a）环己亚乙酸，（b）1-环己烯乙酸，（c）8-羟基庚酸
为了建立CHAA在好氧和厌氧条件下降解的完整途径，根据CHCA的中间结构和降解途径，选择并进一步分析候选降解基因。观察到这些基因的表达水平在生物降解过程中上调（图3b），包括乙酰辅酶A转移酶（atoB）、酰辅酶A脱氢酶（fadI）、烯酰辅酶A水合酶（fadJ）、乙醇脱氢酶（adhP）、羟甲基戊二酸辅酶A裂解酶（hmgL）和琥珀酸半醛脱氢酶（gabD）。6个单基因（ato B、fad I、fad J、adh P、hmg L和gab D）与CHAA（atoB、fadI、fadJ、adhP、hmgL和gabD）的降解有关。atoB被推测为激活CHAA形成羧基辅酶A的关键步骤，羧基辅酶A被鉴定为参与CHCA降解的推定基因的CHCoA形成酶。fadI 和 fadJ 的酶已被证实参与产生乙酰辅酶 A 和 ATP 的β氧化途径，并且在 NA 的代谢中也起重要作用。基因hmgL被证实可以水解裂解芳烃环，并且发现fad I，fad J，adh P，hmgL和gab D的基因参与烷烃和多环芳烃的代谢过程。事实上，JSTW菌株的基因组结果表明，6个降解基因在染色体上（PW_GM001554、PW_GM001560、PW_GM001564、PW_GM001568、PW_GM001569和PW_GM001673）上彼此紧密或相邻，也可能是降解CHAA的特化基因簇。因此，可以推断好氧和厌氧降解途径都通过这些降解基因将CHAA转化为中间脂肪酸。在这里，建立了好氧和厌氧生物降解的途径（图3a）。首先，CHAA的羟基在有氧条件下被atoB激活。然后，CHAA随后的降解与氧无关，好氧途径与厌氧途径一致，直到环己烷环被打开：CHACoA被氧化成烯基辅酶A，在fad I的辅助下形成碳-碳双键（环己亚乙酸辅酶A和环己烯-乙酸辅酶A）。 产物随后通过特定的 fadJ 水合成相应的醇，并通过 adhP 进一步氧化为酮。然后用hmg L参与水解裂解环，形成脂肪族吡小醇辅酶A和长链脂肪酮，由于结构稳定性低，酮容易被氧化或水解为羧基，形成中链脂肪酸。随后的连续β氧化步骤产生短链脂肪酸，从而产生TCA循环。在厌氧降解下，atoB仍保持活性，并通过hmg L完成开环，这与好氧降解途径一致（关键酶活性结果为Text S4）。可以推断，CHAA通过细胞在有氧条件下产生的一系列特异性辅酶A被激活、脱氢和水解，这些辅酶A可以编码参与JSTW菌株CHAA降解途径的atoB、fadI、fadJ、adhP和hmgL的基因，因此CHAA可以在厌氧条件下进行生物降解。在CHAA降解过程中，基因转录的上调（和相应酶活性的诱导支持这一假设。![]()
图3（a） CHAA生物降解途径。（b）主导CHAA生物降解的上调基因图（即针对上调基因的功能基因）
研究内容三：CHAA从好氧状态降解到厌氧状态的细胞反应机制转录组结果表明，共有3216个单基因在CHAA的生物降解中差异表达（基因表达研究一式三份进行，对资料进行相关性和显著性统计分析，结果基于本研究的95%置信区间。基于KEGG分析，在好氧降解和厌氧降解中分别发现了2045个和1171个差异表达基因（DEGs），并选择了20个富集最显著的通路（图4）来了解CHAA生物降解的整体细胞反应机制。在好氧和厌氧降解中，与氨基酸生物合成、双组分系统、2-氧代羧酸代谢、泛酸辅酶A生物合成和细菌鞭毛组装途径相关的基因最多上调，而代谢途径和核糖体RNA降解则下调。在最近的一项研究中，一些蛋白质过表达，这可能代表了 NA 毒性的细胞保护反应，以保护细胞免受环境压力和NA 毒性。可以假设细胞蛋白的过表达是对 NA 毒性的应激反应。因此，在我们的研究中发现了富含氨基酸代谢、辅酶合成、超氧化物歧化酶和趋化性以及其他应激相关基因的上调，也被证明对 CHAA 暴露后的细胞具有剧毒。
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图4（a）有氧降解差异基因表达的 KEGG 通路注释。（b）厌氧降解差异基因表达结果表明，菌株JSTW在有氧条件下CHAA胁迫下表现出明显的趋化性，趋化因子相关基因（MCPs、cheA、cheB、cheW、cheV、cheY和cheZ）在有氧降解过程中明显上调，鞭毛组装基因（fliA、fliG、fliM、fliN、motA和motB）也上调。相比之下，在厌氧生物降解过程中，趋化性基因没有显著上调，但鞭毛组装基因表现出显著上调（flhA、fliG、fliF、flgB、fliC、fliI、flgL、motA等）。结合3.1部分的降解特性，可以推断细菌趋化性可能影响外源CHAA诱导下的细菌行为和细胞内代谢途径，进一步促进厌氧条件下CHAA的生物降解。因此，分析了好氧和厌氧条件下趋化基因的表达，结果表明，好氧条件下趋化因子相关基因显著上调，但厌氧组MCPs、cheA和cheY的表达未上调。因此，我们推测趋化基因是在有氧条件下由CHAA的中间产物诱导的。我们的研究发现，趋化基因 cheA 和 cheY 仅在有氧条件下被诱导，而厌氧条件会阻断趋化过程。这些结果可能表明JSTW的趋化性是氧依赖性的，这解释了CHAA在厌氧条件下不能直接降解。而如果在有氧条件下用 CHAA 诱导 JSTW 菌株，则随后可能会启动 CHAA 的厌氧降解。
此外，还研究了趋化性、生物膜和降解基因（需氧和厌氧条件）之间的关系。相关性分析结果表明，趋化基因与好氧降解基因呈正相关，生物膜基因（fliA）仅在需氧条件下表达，与趋化基因相似。许多研究报告说，常见细菌已被证明对不同的芳烃具有趋化性，并促进了污染物的使用能力取决于趋化性。趋化性和降解基因的协调表达可能是细菌选择最佳生存环境的一般机制，也反映了趋化性与细菌降解的分子关系。在本研究中，编码烯酰辅酶A水合酶的降解基因（fadJ）的表达在CHAA的有氧降解下显著上调。众所周知，生物膜促进底物降解，并且趋化性和降解基因将促进生物膜的形成被认为是合理的，生物膜对CHAA的好氧和厌氧生物降解具有积极作用。因此，推测趋化系统具有引导细菌接近CHAA并诱导细胞形成生物膜和降解基因的作用，从而影响CHAA从好氧条件到厌氧条件的生物降解效率（图5）。![]()
图5 细胞对CHAA的反应机制。趋化性JSTW的信号转导受细胞极的受体复合物和随机分布在细胞周围并埋藏在细胞膜中的鞭毛运动复合物的调节
本研究首次阐明了海洋假交替单胞菌菌株对CHAA从好氧条件到厌氧条件的生物降解机制。CHAA可以在好氧条件下直接降解，但只有在有氧条件下用CHAA诱导细菌时，CHAA的厌氧降解才能完成。降解途径表明，羟基首先被有氧条件下诱导的atoB激活。然后，通过一系列酶催化活化的CHAA，依次形成相应的环己烯、醇、酮，水解裂解，生成脂肪族吡梅洛酰辅酶A。厌氧降解途径与CHAA被atoB激活后的好氧途径一致，直到环被打开。最后，脂肪族聚雌酰辅酶A通过多步β氧化转化为短链脂肪酸，产物最终进入TCA循环。此外，有氧组的酶活性增加，趋化性与降解基因呈正相关。在好氧条件下可以诱导降解和趋化基因，从而增强和完成厌氧环境中的生物降解。这项研究为NAs和其他有机污染物在海洋环境中的命运提供了新的见解。
撰稿：孙宇轩
校稿：曹少攀
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