Optimisation of low temperature (8ᵒC) enzymatic
hydrolysis of acid whey using design of experiments (DOE) for the generation of
thermally stable whey protein hydrolysates
DOI：10.1016/j.foodhyd.2023.109351通讯作者：Richard J. FitzGerald，利默里克大学文章链接：https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2023.109351
酸乳清是酸性酪蛋白生产过程中的副产品。随后使用超滤进行膜处理，可获得蛋白质含量约为 35% 的乳清蛋白浓缩物，即液体酸性乳清蛋白浓缩物 35 (WPC35)。它通常用于多种食品应用，例如婴儿配方奶粉、全脂奶粉、酸奶等，以增加氮/蛋白质含量，即作为营养和风味增强剂以及质地改良剂。与蛋白质含量较高的其他乳清蛋白成分（例如 WPC80 或乳清蛋白分离物 (WPI)）相比，这种特定产品的价值通常较低。因此，人们对从这种侧流中开发新的增值成分产生了浓厚的兴趣。
酶水解已被广泛用于通过破坏三级结构来修饰蛋白质并降低分子量，这可以导致蛋白质水解物成分具有增强/改变的技术和生物功能特性。有充分证据表明，酶水解牛奶蛋白底物（例如酪蛋白酸钠和牛奶蛋白分离物）和其他蛋白质来源（例如啤酒废谷物）可显著提高其溶解度，更重要的是，提高其热稳定性。然而，酸性乳清衍生的 WPC35 并不常用作酶水解的底物。此外，似乎没有关于使用 Prolyve 1000® 水解对 WPC35 技术功能特性的影响的报告。此外，据我们所知，关于酶水解应用来改变酸性乳清衍生的 WPC35 的技术功能特性以及其在酶水解过程中的行为的信息有限。研究了在自由落体 pH 条件下，使用 Prolyve 1000®（一种微生物蛋白酶制剂）生产酸性酪蛋白时，在 8°C 下酶解浓缩液体乳清蛋白 (WPC35) 对所得水解产物的物理化学和热稳定性能的影响。使用实验设计 (DOE) 方法优化水解过程。使用 3 个因子 x 2 个水平生成 11 种水解产物 (H1–H11)，即酶：底物 (E:S) 0.25–1.00% (v/w)，起始 pH 7.5–9.0，孵育时间 10–96 小时。水解产物的水解度 (DH) 值范围为 0.75 (H10) 至 4.74% (H6)，在 54ᵒC x 15 分钟和 64ᵒC 下进行后续热处理（模拟蒸发过程）后，水解度增加至 1.91 (H10) 和 7.24% (H6) x 10 分钟测量所有水解产物的表观粘度 (ηapp)，以评估其在 85°C 加热长达 20 分钟期间的热稳定性，这表明这与 E:S 和 pH 相关。而未水解的样品在 ~74-80ᵒC 加热时形成凝胶。DOE分析发现，E:S 对 DH、完整蛋白质降解程度 (%Deg) 和热稳定性有显着影响。 64ᵒC 处理后的 %Deg 显示与 ηapp 具有很强的相关性（R2 = 0.924；p < 0.001），因此该参数可用于预测水解产物样品的热稳定性。在 8°C 孵育过程中，使用 E:S = 0.625%、起始 pH = 8.65 实现了生成热稳定性 WPC35 水解产物的优化水解条件。在低温下进行蛋白质水解反应有可能提高工艺的可持续性。
许多参数都会影响乳清蛋白的分子特性，从而影响其变性和聚集机制。pH 值和温度都会对乳清蛋白的变性产生重大影响，尤其是在高蛋白质浓度下暴露于 高于60ᵒC 的温度下时。这会导致不可逆变性，从而引起聚集和凝胶形成。乳清蛋白的热诱导变性通常与乳清蛋白分子之间的疏水相互作用和二硫键的变化有关。而在酸性乳清的情况下，据报道有许多参数会影响凝胶形成或凝固，包括盐含量、pH、温度和灰分：蛋白质比。因此，进行了初步实验，以研究 pH 对 WPC35 样品在高达 85ᵒC 的热处理温度下行为的影响。结果显示，WPC35 pH 9.0 样品的凝胶化温度平均值为 73.7ᵒC，而 WPC35 pH 7.5 和8.25样品在80ᵒC加热时均形成凝胶（图1）。
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图1 在64到85ᵒC的热处理过程中，未水解对照样品的凝胶时间和温度与pH值的关系。
这些结果与图2中显示的天然和非还原 PAGE 期间获得的蛋白质图谱一致。WPC35 pH 9.0 样品在 64ᵒC 下加热 10 分钟时出现变性迹象（图2C），其中对应于 α-La 的条带消失，样品在孔顶部相应积累，如在天然和非还原凝胶中观察到的一样。在所有乳清蛋白中，α-La 和 BSA 最容易受到热处理的影响。而 WPC35 pH 7.5 和 8.25 样品在 85ᵒC 下加热 5 分钟后，整体单个乳清蛋白条带强度明显下降，如天然和非还原 PAGE 图谱所示（图2A和B）。乳清蛋白的热诱导变性通常与乳清蛋白分子之间或水解产物中的蛋白质-肽和肽-肽之间的疏水相互作用和二硫键形成增加有关。![]()
图2 未水解对照样品的蛋白质谱A) pH 7.5,B) pH 8.25,C) pH 9.0,D)标准蛋白质、酸性酪蛋白和酸性乳清在天然(顶部面板)和非还原(底部面板)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳后的结果。研究内容二：WPC35水解产物性质
在水解和热处理条件下，监测了WPC35水解物的pH值和水解程度的变化。整体水解曲线如图3所示。反应pH值从反应的初始pH值（pH 7.5-9.0 之间）降低到pH 6.0-6.6，具体取决于所用的反应条件（图3A）。非pH控制水解反应过程中pH值的降低是由于肽键断裂过程中释放了质子 (H+)。而随着孵育温度从8升高到 64ᵒC，整体DH值分别从 0.7-4.7% 增加到 1.9-7.2%（图3B）。根据供应商的规格，Prolyve 1000®是一种微生物丝氨酸蛋白酶制剂，源自地衣芽孢杆菌，最佳水解条件为55ᵒC和pH 8.5（工作范围为 50 至 65ᵒC 和 pH 6.5–11.5）。它具有板特异性枯草杆菌蛋白酶活性。关于酶活性，在50 mM磷酸盐缓冲液pH 8.25 中以 0.5%（v/w）的 E:S 测定时，发现在 50ᵒC 下孵育的酶活性比在 8ᵒC 下的酶活性高 22 倍，使用偶氮酪蛋白作为底物（数据未显示）。这有助于解释在 54 至 64ᵒC 之间随后的热处理过程中获得的更高 DH 值。此外，在8ᵒC水解和随后的热处理过程中，E:S 对获得的 DH 值的影响得到了证实，其中由于使用了不同的 E:S，观察到了 3 种不同的 DH 曲线。例如，使用 1% E:S 生成的样品 H1、H2、H4 和 H6 在 64ᵒC 下孵育 10 分钟后，其 DH 值介于 6.2 和 7.2% 之间。另一方面，使用 0.25% E:S 生成的样品 H5、H7、H10 和 H11 的 DH 值介于 2.2 和 3.5% 之间（图3B）。![]()
图3 水解物样品（H1–H11）在 8ᵒC 孵育后，随后在54ᵒC下热处理0–15分钟（以及在64ᵒC下热处理10分钟（64–10），其pH值(A)和水解度 (DH) (B) 随温度变化的曲线。
研究内容三：使用 RP-UPLC 进行肽分析
进行RP-UPLC分析以研究肽谱，从而评估使用 Prolyve 1000® 水解后完整蛋白质降解的程度。肽谱显示2个主要峰，峰1中为完整 α-La 和 BSA，峰2 中为 β-Lg。这两个主要部分占牛乳清蛋白总蛋白质的70%以上。色谱图还显示了主要完整乳清蛋白的分解，这可以通过水解过程中完整蛋白质降解的程度来证明，与 8ᵒC 孵育相比，在64ᵒC孵育时获得的完整蛋白质降解程度更大。这些结果与 DH 值（图3B）相符，而DH值又可能与 Prolyve 1000® 的最佳操作温度有关，如前所述。尽管如此，结果清楚地表明，水解发生在所采用的不同条件下，其中消化程度取决于水解条件。据我们所知，这似乎是第一项报告 Prolyve 1000® 在低温（即 8ᵒC）孵育期间介导酸性乳清衍生 WPC35 水解的能力的研究。
还需注意的是，反应和随后的加工温度会影响单个乳清蛋白成分的水解速率。例如，β-Lg（峰2）在8ᵒC的反应过程中似乎更容易受到 Prolyve 1000®水解的影响，即完整蛋白质降解率高达16.1%（未显示数据）。而峰 1（α-La 和 BSA）在64ᵒC的热加工过程中显示出更高的降解率，即完整蛋白质降解率在53%到 96%之间（未显示数据）。因此，可以对蛋白质底物进行预处理，例如通过热处理，以展开球状蛋白质的天然结构，从而提高底物对蛋白水解酶的可及性。研究内容四：水解产物样品的热稳定性
热稳定性是蛋白质成分最重要的技术功能特性之一。在本研究中，评估了水解物样品H1–H11在85ᵒC巴氏灭菌过程中的稳定性，评估指标是ηapp随加热时间的变化（粘度斜率：ηapp_slope）、浊度和粒度。大多数乳清蛋白水解物 (WPH) 样品在85ᵒC加热20分钟时保持稳定，但4个WPH 样品（即 H7、H9、H10 和 H11）除外，它们在此处理过程中形成了凝胶或聚集。H7、H10 和 H11 样品是在低 E:S（0.25%，v/w；表1）的水解过程中获得的。而使用中心点水解条件生成的一个样品H9在85ᵒC加热20分钟时发生聚集。这可能与H9样品中完整蛋白质降解的程度有关，与样品 H3 和 H8（>60% Deg @64ᵒC；表2）相比，H9 样品的降解程度较低（57% Deg @64ᵒC）。WPH 样品的凝胶化行为与在 85ᵒC 热处理期间评估的热稳定性参数一致，如图4所示。在 85ᵒC 加热水解物时开始凝胶化，这可以通过在恒定剪切速率 122 s−1 下进行粘度分析时表观粘度的快速增加来证明（见图4A）。在加热的前10分钟内观察到H7、H10和H11样品的粘度显著增加，表明与其他样品相比，这些样品的热稳定性较差。尽管如此，结果表明，与未水解的对照样品相比，酶水解提高了 WPC35 水解物在随后的 85ᵒC 巴氏灭菌过程中的热稳定性，如第 3.1 节所述。类似地，发现水解产物样品的粒度和浊度曲线与水解条件有关（图 5）。水解产物样品的热稳定性较低，这表现为平均粒度（D [4,3]）和浊度值的快速增加（图4B和C）。使用0.25% E:S生成的水解产物样品H7、H10、H11在 85ᵒC下加热5分钟后含有较大的聚集体（D [4,3] 值 > 100 μm）（图4B）。而使用0.625和1.00%（v/w）的 E:S 水解过程中获得的样品中这些参数的变化很小。一些加热20分钟的样品的 D [4,3] 值变化比加热15分钟的样品更大，这可能与在较长的加热时间（即在 85ᵒC 下加热 20 分钟）内形成的更大且更不均匀的聚集体有关。![]()
图4 水解产物样品（H1–H11）在 85ᵒC 加热过程中的表观粘度（ηapp；A）、体积加权平均直径（D [4,3]；B）和浊度（C）以及水解产物样品（H1–H11）在 1、5、10、15 和 20 分钟（85–1/5/10/15/20）的曲线。
研究内容五：DOE 和因子分析结果
为了研究不同反应参数对水解结果的影响，进行了DOE和析因分析。结果发现，除了在64ᵒC下热处理后完整蛋白质降解的程度（数据未显示）外，大多数响应数据不符合线性模型。此外，结果证实了之前概述的观察结果，即E:S对整体水解产物性质（即DH值和完整蛋白质降解）和 85ᵒC 下的热稳定性（即 ηapp_slope）具有最显著的影响（图5）。其他水解参数（pH 值和水解持续时间）及其之间的相互作用对水解结果的影响并不像 E:S 那么明显，如帕累托图（图 6）和概述析因分析系数值的表 S1 所示。值得注意的是，8ᵒC下的孵育时间对 85ᵒC 下加热时的热稳定性没有显著影响（p = 0.323）（图5E）。此外，Pearson 相关性分析表明，样品的热稳定性（以85ᵒC下 ηapp 随加热时间的变化 (ηapp_slope) 表示）与64ᵒC下热处理后完整蛋白质降解程度具有最高的显著相关性（R2 = −0.924；p = 0.000）。因此，该参数可用作 WPH 样品热稳定性的有用预测因子。值得注意的是，完整蛋白质降解率≥60% 的 WPH 样品在 85ᵒC 下长达 20 分钟的热处理过程中没有形成凝胶，也没有聚集。因此，在85ᵒC巴氏灭菌过程中，获得生成热稳定WPH的最佳水解条件的关键参数是获得完整蛋白质降解率≥60%。在这些参数下，最佳水解条件为 E:S = 0.625% 和初始反应pH = 8.64801。根据 DOE 分析，只有 2 个因素（E:S 和 pH）对 64ᵒC 下完整蛋白质降解程度有显著（p < 0.01）影响，因此这些参数被纳入模型（图 6D）。据我们所知，这是第一项报告酸性乳清衍生的 WPC35 在 8ᵒC 下的水解条件对所得 WPH 的热稳定性的影响的研究。![]()
图5 各个水解参数及其相互作用的标准化效应的帕累托图。
研究内容六：优化水解条件下的水解结果
进行了一项验证性研究，以验证从模型中获得的优化设置，其中选择了三个孵育时间，即 16、48 和 72 小时，在 8ᵒC 下进行水解。总体而言，8ᵒC 下的孵育时间对整体水解物性质没有显著影响。在64ᵒC下进行后续热处理后，反应 pH 值从8.65降至6.50。虽然在64ᵒC下加热时 DH 值从 3.5% 增加到 6.1%，但这与之前在图3B中观察到的范围相似。就 WPH 样品在85ᵒC热处理期间的热稳定性而言，加热20分钟期间没有发生凝胶形成。这证明了WPH样品在这些热处理条件下的稳定性，从而验证了模型预测（图 S3C-D）。评估了优化样品的肽谱，以确定在 64ᵒC 热处理后完整蛋白质的降解程度。结果发现，完整蛋白质降解的实验值在 95% 预测区间范围内，即 45.625 到 74.375% 之间（未显示数据），并且观察到的实验值和预测值之间没有显着差异（p = 0.061）。此外，根据观察到的这些参数之间的显著线性相关性，完整蛋白质降解的程度也用于预测 DH 值。结果发现，实验值和预测值的 DH 值并没有显示出显著差异 (p = 0.247)。因此，结果表明，在 8ᵒC孵育期间，E:S为0.625%和初始pH = 8.65的水解条件是最佳的，可在85ᵒC巴氏灭菌后生成热稳定的 WPC35 水解物成分。
本文的研究结果表明，使用 Prolyve 1000® 对 WPC35 进行酶水解可以在 8ᵒC下进行，从而使水解产物在随后的 85ᵒC 巴氏灭菌过程中具有增强的热稳定性。研究发现，完整蛋白质降解程度是随后在 85ᵒC 下进行巴氏灭菌过程中样品稳定性的良好预测指标。生成热稳定 WPC35 水解物成分的优化水解条件为 E:S = 0.625% 和初始反应 pH = 8.65。根与传统的高温水解反应（即在 50 °C 下孵育）相比，这代表了一种生成蛋白质水解物成分的节能且经济的加工策略。本文阐明的优化水解条件可能需要在转移到商业规模生产过程中进一步验证。
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