研究背景
在乳腺癌的临床病理诊断中，微浸润性乳腺癌（MIBC）的精准诊断是个难点问题。
MIBC是大小不超过1 mm的乳腺浸润性癌，可以通过孤立异型上皮巢周围是否存在肌上皮细胞来确认是否为浸润灶。由于病灶体积极小，病理医师仅靠HE染色切片辨认会很困难。通常使用肌上皮细胞抗体（例如p63、calponin等）进行IHC染色辅助诊断，若未见上皮细胞周围的肌上皮细胞着色，且肿瘤细胞巢直径<1 mm，即可诊断为MIBC。
但是，用肌上皮细胞抗体染色时，无法显示肿瘤组织（由上皮构成），就需要借助形态学确认，如果MIBC肿瘤细胞被非癌细胞（例如成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞等）掩盖时，就会出现漏诊。另一方面，由于微浸润病灶通常较小，多次连续切片IHC检测可能会造成微浸润灶缺失，诊断的精准性就会欠缺。
研究内容
为了提高MIBC的确诊率，一项研究纳入三个研究列队：研究列队1：18例非肿瘤性乳腺组织；研究列队2：34例原诊断为导管内癌伴可疑浸润病例和29例原诊断为乳腺高级别导管原位癌病例；研究列队3：309例初诊为多导管导管内癌的病例及乳腺微浸润癌病例进行检测。
通过IHC方法将常用的肌上皮细胞标志物（calponin和p63）和上皮细胞标志物（E-cadherin和CK7），进行单抗体、双抗体及三抗体等8种组合，其中双抗体及三抗体组合包括顺序法及鸡尾酒法，对研究列队1进行IHC染色，确定calponin/p63+E-cadherin为最优抗体组合。
图1 正常乳腺组织A为HE低倍放大；B示鸡尾酒calponin/p63+E‐cadherin双重免疫组织化学染色中倍放大；图2 乳腺导管原位癌伴多灶浸润（箭头示浸润灶） 图A为HE低倍放大；图B为鸡尾酒calponin/p63+E‐cadherin双重免疫组织化学染色中倍放大，左上角图为浸润灶、微浸润灶的放大高倍放大；图3 乳腺导管原位癌伴微浸润（箭头示微浸润灶）图A为HE高倍放大;图B为鸡尾酒 calponin/p63+E‐cadherin双重免疫组织化学染色高倍放大；图4 乳腺高级别导管原位癌伴微浸润 图A为HE中倍放大；图B为鸡尾酒calponin/p63+E‐cadherin双重免疫组织化学染色高倍放大。
研究列队2的34例原诊断为乳腺导管内癌伴可疑浸润的病例中，calponin/p63+E-cadherin三抗体染色方案中共检测到21例（61.7%）为明确浸润，其中14例为微浸润（41.2%），所有浸润灶均清晰易见，无论是孤立性浸润、多灶浸润或是几个细胞的浸润。在29例高级别导管原位癌中，4例（13.8%）检测到微浸润灶。
研究列队3中，calponin/p63+E-cadherin三抗体染色方案在日常病理诊断中明显提高了微浸润的确诊率，乳腺微浸润癌的确诊率由67.96%提升到89.97%，可疑微浸润的报告率由32.04%下降至10.03%。诊断为明确微浸润的报告率由77.19%提升到95.74%，而可疑微浸润的报告率由22.81%下降至4.26%。
研究结论
研究局限性
Calponin/p63+E-cadherin三抗体染色方案，受到鸡尾酒染色法和抗体种属限制，在抗体筛选上受到了限制。肌上皮细胞的标志物，除了Calponin、p63外，还有CK5、CK14等，对于硬化性病变或导管受到严重挤压等问题，需要考察多个肌上皮标志物的表达状态，才能精准诊断。与此同时，上皮细胞标志物E-cadherin也存在覆盖度不足的问题，还可以选择CK7、CK18等。因此，想进一步提供乳腺微浸润癌的诊断率，应该同步考察更多的检测指标。
mIHC助力微浸润性乳腺癌的精准诊断
多重荧光免疫组化技术（mIHC），是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶标蛋白进行高密度原位标记的酶学检测方法。基于该技术，可以在一张石蜡切片中进行最多9种靶标蛋白的染色，并统计不同组织区域中细胞类型、密度，空间位置关系等信息。因此，利用mIHC技术，在一张组织切片中，可同时标记Calponin、p63、CK5、CK14、E-cadherin、CK7和CK18等指标，更清晰、更准确地标注出乳腺浸润性癌成分，显著提高乳腺微浸润癌的确诊率。
mIHC在乳腺癌的应用价值
在乳腺癌领域，mIHC在临床应用中具有广泛的潜力，可以用于诊断、预后评估和指导治疗等方面。具体表现为：
1、乳腺癌的精准诊断和分型：通过mIHC同时检测ER、PR和HER2、Ki67等指标的表达情况，确定乳腺癌的分子分型，为内分泌治疗和HER2靶向治疗提供依据；通过检测AR、CD8、FOXC1、DCLK1，可以进一步对三阴性乳腺癌进行分型，制定个性化治疗方案。与传统IHC相比，mIHC可以在一个切片上完成多标志物检测，减少组织样本的消耗，同时提升诊断效率。
2、量化病理诊断结果：相较于IHC的定性或半定量分析，通过mIHC技术能够定量分析Ki67、ER、PR、HER2的表达水平，提高评估的准确性和可重复性，辅助判断乳腺癌的恶性程度、患者预后和治疗效果。
3、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分析：mIHC技术可以检测并定量分析乳腺癌组织中TILs的类型、浸润位置和数量，全面评估三阴性乳腺癌的免疫状态；揭示乳腺癌肿瘤内和肿瘤间的异质性，发现不同肿瘤细胞群体的分布和特性，提供免疫治疗潜在效果的预测依据，为个体化免疫治疗策略的制定提供支持。
图2 mIHC乳腺癌样本的染色实例
阔然生物致力于mIHC的技术推广和临床转化，已率先完成全线产品的布局，并形成“多标染色试剂+染色机+扫描仪”一体化解决方案。基于mIHC能够深入研究肿瘤微环境，助力乳腺癌的精准诊疗。
1. 免疫组织化学三抗体鸡尾酒双染法对乳腺微浸润癌的诊断价值.中华病理学杂志,2020，49(10) : 1061-1061.
2. 中国乳腺导管原位癌病理诊断共识（2022版）, 中华病理学杂志, 2022,51(9): 812-818.
3. 免疫组织化学在乳腺病理中的应用共识（2022版）, 中华病理学杂志, 2022,51(9) : 803-811.
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