脑胶质瘤是指起源于脑神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，2021年版 WHO 中枢神经系统肿瘤分类将脑胶质瘤分为1～4级，1、2级为低级别脑胶质瘤，3、4 级为高级别脑胶质瘤。我国脑胶质瘤年发病率为5～8/10万，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌。脑胶质瘤发病机制尚不明了，目前确定的两个危险因素是：暴露于高剂量电离辐射 和与罕见综合征相关的高外显率基因遗传突变。此外，亚硝酸盐食品、病毒或细菌感染等致癌因素也可能参与脑胶质瘤的发生。
脑胶质瘤治疗以手术切除为主，结合放疗、化疗等综合治疗方法。手术可以缓解临床症状， 延长生存期，并获得足够肿瘤标本用以明确病理学诊断和进行分子遗传学检测。手术治疗原则是最大范围安全切除肿瘤，而常规神经导航、功能神经导航、术中神经电生理监测和术中 MRI实时影像等新技术有助于实现最大范围安全切除肿瘤。放疗可杀灭或抑制肿瘤细胞，延长患者生存期，常规分割外照射是脑胶质瘤放疗的标准治疗。胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）术后放疗联合替莫唑胺同步并辅助替莫唑胺化疗，已成为成人新诊断 GBM 的标准治疗方案。
肿瘤微环境（TME）被认为是肿瘤细胞产生和生存的内环境，TME中的免疫细胞通过细胞-细胞和细胞-基质相互作用的方式形成有利于肿瘤进展的微环境，免疫细胞可以阻止肿瘤生长，但也可以通过影响肿瘤的免疫原性导致肿瘤对治疗的耐药性。因此，深入研究胶质瘤的肿瘤微环境，有助于了解胶质瘤时空动态变化特点及不同治疗方案中药物的相互作用机制，从而制定精准诊疗新策略。
多重荧光免疫组化技术（Multiplex immunohistochemical，mIHC），是一种利用辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase，HRP）对靶标蛋白进行原位标记的检测方法，可以在一张石蜡切片中进行多种靶标蛋白的染色和成像，结合图像分析软件可统计不同组织区域中细胞类型、个数、密度，空间位置关系等信息。mIHC与单细胞测序、空间转录组、蛋白质组学、微生物组学等多组学技术联用，可以原位验证关键差异蛋白的表达，研究细胞通讯和互作关系，全面研究胶质瘤的肿瘤微环境。因此，我们就来盘点下近年来mIHC在胶质瘤研究中的代表案例。
01
缺氧驱动GBM形成5层组织结构
研究背景
胶质母细胞瘤 (GBM) 是一种高度异质性、侵袭性的脑肿瘤。传统的组织病理学对GBM空间复杂性的认识有限，无法深入了解细胞空间排列及其与微环境的相互作用对肿瘤行为的影响。
研究解读
利用空间蛋白组学技术结合空间转录组方法，深入研究了GBM的复杂空间组织特征。通过量化细胞状态之间的空间关系，结构化区域内包含由缺氧驱动的五层细胞结构，包括核心缺氧/坏死（MES-Hyp）、缺氧相关细胞（MES-Ast、MES-like 和 Inflammatory-Mac）、血管生成和免疫细胞（Vasc、Mac 和 Prolif-Metab）、恶性神经发育状态（AC 样、OPC 样和 NPC 样）和浸润性脑实质（Reactive-Ast、Oligo 和 Neuron）。这种细胞分层远超出传统组织病理学的观察能力，拓展了传统组织病理学对GBM的分类，为理解胶质母细胞瘤的空间复杂性提供了一种全面而创新的方法。深入了解空间组织如何影响GBM治疗效果和耐药性，为研究和临床实践开辟了新的思路和方向。
02
胶质瘤肿瘤相关TAM新亚型
研究背景
单核细胞来源的TAM（Mo-TAM）多在胶质瘤瘤体内富集，且其含量增加与肿瘤复发和患者预后不良有关。但胶质瘤内的Mo-TAM是否存在表型异质性及其形成机制尚不清楚。
研究解读
该研究利用单细胞多组学技术绘制了恶性胶质瘤Mo-TAM空间图谱，通过mIHC检测发现缺氧坏死区高度富集Hypoxia-TAM亚群，阐明了缺氧坏死微环境诱导Hypoxia-TAM亚群表型极化的关键机制，发现Hypoxia-TAM是诱导恶性胶质瘤微血管高度渗漏的重要原因，建立了靶向Hypoxia-TAM以诱导胶质瘤血管正常化，提高抗肿瘤治疗药物递送和疗效的治疗新策略，有望用于推动靶向胶质瘤内不同来源、不同功能TAM的免疫治疗新策略和抗肿瘤血管生成新策略的研发。
03
mIHC助力胶质母细胞瘤CAR-T治疗研究
研究背景
胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性和致死性的脑肿瘤，尽管有手术切除、放疗和化疗等联合治疗策略，但患者结局较差，嵌合抗原受体（CAR）-T疗法为GBM治疗提供了新策略。
研究解读
一项I期临床试验入组8例GD2阳性GBM患者，通过单独静脉给药或静脉联合腔内给药，输注自体GD2特异性4SCAR-T细胞。研究发现，4SCAR-T细胞在外周血中扩增1-3周，并以低频率持续存在。在8名可评估的患者中，4名患者在输液后3至24个月表现出部分反应，3名患者病情进展6至23个月，1名患者病情稳定4个月，输注后的中位总生存期为10个月。在一例输注4SCAR-T再行肿瘤切除后死亡的样本中，通过多重荧光免疫组化技术（mIHC）表征CAR-T治疗前后GD2、CD8、CD163的表达情况，发现4SCAR-T细胞重塑了M2巨噬细胞介导的的抑制性免疫微环境，刺激了肿瘤微环境中的免疫反应。该临床试验强调了GD2特异性4SCAR-T细胞靶向GBM的安全性，有必要进行更大规模的II期研究。
04
AAV-LIGHT法可促进胶质瘤的抗肿瘤免疫
研究背景
胶质母细胞瘤（GBM）是侵袭性脑肿瘤，对免疫治疗不敏感。高度免疫抑制的微环境和GBM相关的血管系统功能障碍阻碍了T细胞向肿瘤的浸润，因此，亟需能够促进GBM抗肿瘤免疫反应的治疗方法。
研究解读
该研究使用脑内皮细胞靶向腺相关病毒(AAV)载体在小鼠GBM的脉管系统中表达LIGHT (AAV-LIGHT)。发现，全身AAV-LIGHT治疗可诱导肿瘤相关的高内皮小静脉（HEV）和富含T细胞的三级淋巴样结构（TLS）的形成，促进T细胞的启动和浸润到肿瘤中，显著延长抗PD -1耐药GBM小鼠的生存期。AAV-LIGHT治疗可减少T细胞衰竭，促进TCF1+ CD8+干细胞样T细胞，并延迟了向耗竭性T细胞的分化。使用七色多重荧光免疫组化技术（Panel组成：CD8、CD4、CD19、TCF1、CD11c、CD31、Nuclei）分析发现在AAV-LIGHT组中，TLS和肿瘤内均存在TCF1+ CD8+ T细胞，而且更常聚集到与CD11c+ DC（抗原呈递）密切相互作用的微环境中，并定位于类似HEV的CD31+血管附近。
该研究表明，通过靶向表达LIGHT来改变血管表型可以促进有效的抗肿瘤T细胞反应并延长胶质瘤的生存期，是一种有希望的GBMs治疗选择，包括那些对检查点阻断无反应的GBMs，这些发现对其他免疫治疗耐药癌症的治疗具有更广泛的意义。
05
IL-8是胶质瘤的联合免疫治疗靶点
研究背景
恶性胶质瘤的预后非常差，尽管免疫检查点阻断(ICB)在多个癌种中取得了显著的成功，但在恶性胶质瘤的临床获益中仍不明显。
研究解读
为了探索潜在的免疫调节因子，该研究分析了152名胶质瘤患者的肿瘤微环境（TME），发现肿瘤浸润的T细胞主要局限于血管周围袖口，并表达高水平的CCR5、CXCR3和PD-1。CXCR3和CCR5是T细胞迁移到胶质瘤并执行肿瘤杀伤功能所必需的。结合scRNA-seq和scTCR-seq结果发现CD4+ T细胞的一个独特亚群（IL-8+CD4+ T细胞）在体内具有促进肿瘤生长和髓系细胞（MDSC）募集的先天特征，并与不良预后相关。IL-8的T细胞约占肿瘤浸润CD4+ T细胞总数的10%。抗PD -1治疗后会增加IL-8表达和MDSC募集，从而降低抗PD -1治疗的疗效。IL-8阻断剂可以通过消除MDSCs和肥大细胞以及TAMs的再生，将胶质瘤TME从促肿瘤状态重塑为抗肿瘤状态，从而与ICB治疗协同产生整体抗肿瘤免疫应答。针对IL-8/CXCR1/ CXCR2轴联合ICB可能有益于胶质瘤患者，该研究结果提示IL-8可作为胶质瘤联合免疫的治疗靶点。
阔然生物致力于mIHC的技术推广和临床转化，已率先完成全线产品的布局，并形成“多标染色试剂+染色机+扫描仪”一体化解决方案。基于mIHC能够深入研究胶质瘤的肿瘤微环境，探索肿瘤微环境与胶质瘤发生发展、复发、转移、耐药的关系，挖掘与肿瘤相关的预测性生物标志物，助力胶质瘤的精准诊疗。
[1]Cell. 2024 May 9;187(10):2485-2501.e26.
[2]Cancer Cell. 2024 Apr 16:S1535-6108(24)00119-3.
[3]Mol Cancer. 2023 Jan 9;22(1):3.
[4]Cancer Cell. 2023 Jun 12;41(6):1134-1151.e10
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