近日，中国科学院微生物研究所刘双江研究员团队和李德峰研究员团队在Journal of Hazardous Materials上发表了题为“Sphingobium sp. SJ10-10 encodes a not-yet-reported chromate reductase and the classical Rieske dioxygenases to simultaneously degrade PAH and reduce chromate”的研究论文。本研究分离了一株能够有效降解多环芳烃（PAHs）同时还原高毒性六价铬的鞘脂菌Sphingobium sp. SJ10-10，发现了该菌基因组中编码多个启动多环芳烃降解的Rieske非血红素铁环羟化双加氧酶（RHOs）和一种未报道的铬酸盐还原酶（SchR），揭示了PAHs-Cr复合污染物的去除机制。研究结果为复合污染环境生物修复策略的制定提供了新思路。
环境中的多环芳烃(PAHs)和重金属均对生物体造成毒害，它们的共存使其在生物修复过程中更难去除，从而对环境管理和公共卫生构成挑战。因此，需要能够有效应对这两种污染物的微生物来改善生物修复过程。本研究从废弃的焦化厂中分离出一个新菌株Sphingobium sp. SJ10-10，它能在36小时内同时降解92.6%的75 mg/L的菲和90%的3.5 mg/L的六价铬。在PAH-Cr复合污染条件下，菌株SJ10-10通过共代谢方式降解多种PAHs和还原六价铬，结果证实了它对两种污染物的同步转化能力。在分子水平上，其编码多种Rieske非血红素铁环羟化加氧酶(RHOs)来启动PAHs降解，但它们表现出不同的底物特异性。本研究还发现了一种未被报道的蛋白质可以还原Cr(VI)，将其命名为鞘氨醇菌铬酸盐还原酶 (SchR)。SchR也分布在不同的微生物中，尤其在含有RHO的鞘脂菌成员中广泛存在。根据同源性可将SchR分为两类：一类来自鞘脂菌成员，另一类来自非鞘脂菌物种。本研究表明鞘脂菌代表了一类用于复合污染生物修复的优秀菌株资源，SchR介导的铬还原机制为控制复合污染的微生物修复策略提供了有价值的见解。
随着工业化发展，大量有机的和无机的污染物排放到环境中，很多工业场地（如焦化厂、炼钢厂、发电厂等）存在多环芳烃和重金属同时污染的情况，严重危害了人们的身体健康，所引发的环境问题亟待解决。微生物修复作为一种经济有效且环境友好的治理策略受到越来越多的关注。目前研究表明，许多微生物表现出了独立降解PAHs或者减低重金属毒性的能力，如Streptomyces, Rhodococcus, Acinetobacter, Mycobacterium等能降解多环芳烃，Pseudomonas, Bacillus, Shewanella等被广泛报道可以还原六价铬。但是，由于多种污染物共存时会导致环境毒性叠加，在实际应用中，利用这些微生物作为修复手段的有效性受到挑战和质疑。因此，找到同时处理这些复杂污染物的细菌并研究其降解转化机制对提高生物修复水平至关重要。
本研究从一个废弃焦化厂的土壤样品中分离得到菌株SJ10-10。该菌能够在含50 mg/L重铬酸钾的R2A培养基或者在含有80 mg/L芳香化合物和25 mg/L 重铬酸钾的无机盐培养基中生长，并能在涂有菲作为唯一碳源的无机盐琼脂平板上产生明显的降解圈。基于16S rRNA基因和全基因组的系统发育分析表明，菌株SJ10-10与近亲Sphingobium chlorophenolicum NBRC 16172T的相似度为98.67%, 平均核苷酸均一性和DNA-DNA杂交值分别为86.20% 和33.5% （均低于区分两个物种的阈值），说明菌株SJ10-10可能是鞘脂菌属Sphingobium的一个潜在新物种。
在多种PAHs混合的条件下，菌株SJ10-10对菲、荧蒽、苯并( a )蒽和苯并(a)芘都有显著降解作用，而在单一多环芳烃为碳源情况下只对菲产生有效降解，说明SJ10-10通过共代谢方式降解高环PAHs（图2a）。在含重铬酸钾的R2A培养基中评估了其抵抗六价铬毒性的能力，当Cr(VI)浓度低于7 mg/L 时对其生长影响较少，浓度高于10.5 mg/L时，对数生长期逐渐推迟并延长，表明菌株能耐受一定浓度的Cr (Ⅵ)毒性，但更高浓度Cr (Ⅵ)影响了细胞的增殖能力（图2b）。菌株SJ10-10能有效还原20.0 mg/L的六价铬（图2c），且80%以上的还原产物在去细胞的上清液中被回收，说明还原产物大部分以溶解态形式存在于胞外（图2d）。
在多种PAHs混合并复合Cr(VI)的条件下，菌株SJ10-10可以降解98.3%的菲，81.7%的荧蒽，27.3%的苯并(a)蒽和5.8%的苯并(a)芘，并转化99.3%的Cr(VI)（图3a）。将4种浓度的菲 （100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L）分别与10 mg/L重铬酸钾复合，发现3天内可降解99.7 %, 97.9 %, 79.4 %和50.6 %的菲并同时还原97%的Cr(VI)（图3b）。将4种浓度的Cr(VI) （2 mg/L, 4 mg/L, 8 mg/L和12 mg/L）与100 mg/L的菲复合，其能够分别转化98.2 %, 97.5 %, 40.3 %和 22.0 %的Cr(VI)并且降解100%的菲（图3c）。从菲-Cr(VI)复合物的降解曲线中看出，3.5 mg/L的六价铬没有影响菲的降解，但是削弱了细菌的生长，培养36 h时90%以上的菲和Cr(VI)被降解和还原（图3d-e）。结果表明，SJ10-10能同时降解PAH和转化六价铬。
Rieske非血红素铁环羟化加氧酶(RHOs)是启动PAH降解的第一步起始酶。通过对降解功能基因的分析发现，SJ10-10基因组编码多个RHOs，它们在2个质粒上形成基因簇排列，包括，萘双加氧酶 (phnA/B, nahAc1/d1, and nahAc2/d2)，联苯双加氧酶 (bphAc1/d1 and bphAc2/d2), 苯甲酸双加氧酶 (benA/B-xylX/Y), 水杨酸单加氧酶 (nahG/H), 邻氨基苯甲酸双加氧酶 (antA/B) 和对苯二酸双加氧酶 (tphA2/A3)。此外，负责下游脱氢、去饱和、开环的酶（如nahB, nahC, nahD和 nahE）以及中心代谢途径的酶（如 mhpC, mhpD, hpcH, adhE和hmgA）也与RHOs紧邻分布在基因簇上（图4a）。在这些RHOs中，3个萘双加氧酶可能参与PAH的降解，随后对它们进行了异源表达和酶活特性的分析。结果表明，3个RHOs具有PAH底物特异性，其中phnAB催化萘、菲、荧蒽和苯并(a)蒽等4种PAHs的氧化，nahAcd2催化萘和菲的氧化，而nahAcd1仅对萘有明显的催化作用（图4b）。进一步对phnAB催化菲降解的产物进行了定性和定量分析，核磁结果显示该酶将菲氧化成了顺式-菲-(3S,4R)-3,4-二氢二醇，催化效率达到99%（图4d），最大反应速率Vmax 为26.7 ± 7.1 mg/L/d，Km值为48.2 ± 27.4 mg/L（图4e）。
基于菌株SJ10-10的六价铬还原能力，本研究试图在其基因组中检索已报道的铬酸盐还原蛋白（包括ChrR, yeef和LdDH）的潜在同源物，结果没有发现任何基因与这些已知的铬酸盐还原酶有显著的相似性。然而，本研究分析确定了一个由基因VVT58_RS07700编码的假定黄素蛋白，它与已知的ChrR (BCA76243.1) 仅具有57%的覆盖度和26.2%的序列相似度，其功能尚未公开。
为了评估该蛋白还原Cr(VI)的能力，对该基因进行了异源表达并获得纯酶。体外实验表明，大约55%-60%的Cr(VI)在0.5小时内被该酶还原（图5a）。酶动力学分析表明，在3-75 mg/L (0.03 mM - 0.7 mM Cr2O72-)浓度下，该蛋白还原Cr(VI)的最大反应速率Vmax为138.6±20.8 mg/L/h (1.2±0.19 μmol/min/mg蛋白)，Km为93.1±21.4 mg/L (1790.3±411.5 μM)（图5b）。这些结果明确证实了该蛋白的Cr(VI)还原能力，本研究将该蛋白命名为Sphingobium chromate reductase (SchR)。
对SchR的分布特点进行了分析，发现其广泛分布在不同物种中，在鞘脂菌属内SchR显示70%-100%的同源性，而与其他属的同源性约小于60%。有趣的是，其他属的SchR同源性却相对较高（图5c），说明SchR大致分为两种类型：一类属于鞘脂菌，一类属于菲鞘脂菌。鉴于鞘脂菌是一种被广泛认可的高效有机污染物降解菌，并且SchR具有属特异性的特征，本研究进一步探究了RHO和SchR的共存情况，以评估鞘脂菌同时降解多环芳烃和还原六价铬的潜力。在编码RHO的33个鞘脂菌成员中有16个同时编码了SchR的同源物，表明该属中RHOs和SchR明显共存（图5d）。这些发现指出鞘脂菌在同步去除多环芳烃和六价铬方面的潜力，使其成为一个处理复合污染物的优秀菌株资源。
本研究提出了一种值得关注的、能利用经典RHO降解途径和一种新型铬酸盐还原酶同时去除PAH和Cr(VI)的细菌。菌株SJ10-10分离自一个废弃焦化厂，属于鞘脂菌的一个潜在新种。它在降解多环芳烃和还原六价铬方面都展现了出色的能力。在该菌中发现的新型铬酸盐还原酶SchR广泛分布于常见的多环芳烃降解菌Sphingobium中，表明鞘脂菌是一种在多环芳烃和六价铬共存场景中进行生物修复的候选菌，进一步对以SJ10-10为代表的鞘脂菌进行研究和应用将为环境生物修复领域做出重要贡献。
