第一作者：王超，刘晓鑫
通讯作者：邓洁薇 副教授
通讯单位：广东工业大学
论文DOI：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.134485
2、3、7、8-四氯二苯并-对二恶英（TCDD）是一种剧毒的持久性有机污染物，可引起细胞DNA损伤。尽管TCDD引起氧化应激和基因毒性受到了广泛的研究，但两者的关系及其对DNA的损伤机制仍有待进一步探讨。本研究发现TCDD诱导HeLa细胞中ROS生成和AP位点DNA损伤具有相同趋势。进一步研究发现，TCDD破坏了超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，破坏了细胞的抗氧化防御系统，进而增加了O2.−和NO的产生，导致氧化应激过程中AP位点的DNA损伤。碱基切除修复（BER）通路中关键基因的表达以及阻断O2.−和NO后的表达导致AP位点DNA碱基损伤的缺失进一步验证了我们的研究结果。此外，转录组测序还显示，TCDD通过上调丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、环磷酸腺苷（cAMP）和乳腺癌通路中与氧化应激相关的基因来诱导DNA损伤（图1）。
高内涵荧光成像同时监测TCDD诱导HeLa细胞中ROS生成和AP位点DNA损伤，发现其诱导产生的APE1导致的AP位点的DNA碱基损伤与ROS的增加同时发生。进一步计算了每个HeLa细胞的荧光强度，并获得了12 h和24 h的一系列数据点。构建了典型的小提琴散点图，数据分布显示，随着TCDD浓度的增加，12 h和24 h的AP位点的DNA碱基损伤和ROS的增加与TCDD的浓度呈剂量依赖性（图2）。
选择高、中、低三种浓度（10、100、300 nM）TCDD暴露后检测了细胞抗氧化防御的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。随着TCDD浓度的增加，SOD和CAT酶活性呈剂量依赖性的增加（图3A-B），表明TCDD损伤了细胞内的抗氧化防御系统。随后，使用线粒体O2.−探针和NOS探针检测细胞中O2.−和NO水平的变化。如图3C-D所示，TCDD诱导了HeLa细胞中O2.−和NO水平的升高，且呈浓度依赖性。
使用线粒体O2.−清除剂Tempol和NOS抑制剂7-NI，抑制O2.−并阻断线粒体NOS的活性（图3A-B）。同时，用ZnO2@DNA荧光探针检测TCDD暴露诱导的HeLa细胞的DNA损伤。荧光成像显示，当O2.−/ONOO−未被清除和NOS未被阻断时，细胞内DNA损伤呈浓度依赖性的增加（图 4A）。然而，当使用O2.−/ONOO−清除剂或NOS阻断剂时，没有观察到荧光信号（图 4B）。这些结果表明，TCDD暴露可诱导HeLa细胞氧化应激产生O2.−和NO，导致AP位点的DNA碱基损伤。
BER是一种主要的氧化应激引起DNA碱基损伤的修复途径。当细胞内DNA的氧化损伤程度较高时，相应的BER修复途径中的APE1酶的表达也会增加。细胞中的APE1可以特异性地识别DNA探针中的AP位点。通过Western blot检测BER通路中的APE1蛋白的表达，发现TCDD可以显著增加APE1蛋白的表达（图5B）。为了进一步探讨TCDD对BER通路的影响，使用q-PCR测定了BER通路中几个关键调控因子OGG1、APEX、FEN1、POLB和POLD、XRCC1、PARP1基因的表达（图3A）。结果显示，TCDD暴露后HeLa细胞中多个基因的表达显著增加，且呈TCDD浓度依赖性，其中OGG1和APE1是最常见的指示DNA氧化损伤基因。两者的显著性差异最大。
转录组差异表达基因（DEGs）分析结果发现，CYP1A1、CYP1B1、IL1A、ALDH3A1、NR1D1、TIPARP等基因的表达均显著上调。这些基因在氧化应激引起的DNA损伤中起着至关重要的作用。此外，SGK1、HSPA8、HSPA1A、TM4SF1、NPR3等基因的异常表达与肿瘤的发病机制密切相关，证实了TCDD的致癌性。通过构建差异基因簇热图可视化了TCDD暴露组和对照组中的DEGs。两组在氧化应激后，DNA损伤基因CYP1A1、CYP1B1、IL1A、ALDH3A1、NR1D1、TIPARP以及基因SGK1、HSPA8、HSPA1A、TM4SF1、NPR3的表达均有显著性差异（图6C）。利用GO富集分析进一步探索了这些DEGs的功能，在TCDD处理HeLa细胞后，富集最大的三种生物功能是蛋白结合、膜成分和质膜成分（图6D）。富集的三大功能的生物过程中，信号转导、RNA聚合酶II对转录的正调控、转录调控和DNA模板最为丰富。在细胞组分中，细胞膜、细胞质和质膜组分最丰富。分子功能方面蛋白质结合最为丰富，其次是金属离子结合和核苷酸结合（图6E）。
随后，对暴露于TCDD后的HeLa细胞中的DEGs进行了KEGG富集分析，主要富集在MAPK、昼夜节律、雌激素、乳腺癌、cAMP和基底细胞癌等相关的信号通路（图7A）。这些通路主要分布在环境信息处理和人类疾病这两个模块中（图7B）。我们进一步对与氧化应激诱导的DNA损伤相关的与氧化应激相关的DEGs，如CYP1A1、NR1D1、IL1A、GADD45和NFκB进行了q-PCR验证，实验结果与转录组结果一致（图7D）。此外，在乳腺癌和MAPK通路中富集的IL1A、GADD45、FOS、JUN、NFκB等基因在DNA损伤修复、细胞周期和凋亡中也发挥重要作用（图5C）。
本研究发现TCDD升高了超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，破坏了HeLa细胞的抗氧化防御系统，增加了O2.−和NO的产生，导致氧化应激过程中AP位点的DNA碱基损伤。通过分子生物学手段检测BER通路中关键基因表达和阻断O2.−和NO后AP位点DNA碱基损伤的缺失，进一步验证了TCDD通过氧化应激水平诱导细胞AP位点的DNA碱基损伤。转录组测序显示，TCDD通过上调丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、环磷酸腺苷（cAMP）和乳腺癌通路中与氧化应激相关的基因来诱导DNA损伤。本研究有助于评价TCDD诱导的氧化应激和DNA损伤的基因毒性机制，对评价TCDD对生物体的潜在毒性具有重要意义。
作者简介
王超，广东工业大学在读博士研究生，主要从事有机污染物分析和毒理研究。以第一作者在J. Hazard. Mater.期刊上发表SCI论文2篇。
通讯邮箱：cwang8@163.com
邓洁薇，博士，硕士生导师，广东工业大学生物医药学院副教授。主要从事有机污染物分析和毒理研究，研究成果在Anal. Chem.、J. Hazard. Mater.、Environ. Sci. Technol.、Sci. Total Environ.、Trends Anal. Chem.等期刊上发表SCI论文50余篇，论文他引1000多次。主持国家自然科学基金面上、青年项目等纵向项目8项，参与国家自然科学基金重大科研仪器研制项目的核心研究工作，担任《J. Anal. Testing》、《分析试验室》、《分析测试学报》期刊青年编委、中国分析测试协会青年学术委员、广东省药学会生物医药分析专委会委员、广东省精准医学应用学会医工结合分会委员。
通讯邮箱：jwdeng@126.com
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