近日，天津科技大学刘继锋教授在Journal of Hazardous Materials上发表了题为“Degradation of Di (2-ethylhexyl) phthalic acid plasticizer in baijiu by a foam titanium flow reactor attached with hairpin-like structured peptide enzyme mimics”的研究论文。本研究成功合成了可水解二（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯（DEHP）的多肽，并将多肽结合到泡沫钛上制成了可重复利用的泡沫钛流式反应器，实现对白酒中DEHP的去除。同时通过计算模拟揭示了多肽水解DEHP的主要作用机制，该研究结果为水解DEHP提供了新的思路。
二（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯（DEHP）是一种常见塑化剂所带来的显著环境和健康危害。其对环境的污染也可能引发严重的食品安全问题，因为种植在受到塑化剂污染土壤中的作物会将塑化剂转移到白酒中。此外，在白酒发酵和加工过程中使用塑料包装或容器时，塑化剂也会污染产品。在这项研究中，将具有催化活性的氨基酸加入到具有发夹结构序列的多肽中实现对DEHP的降解，并进一步通过在多肽氮端引入咖啡酸，使这些多肽可以通过烯二醇-金属相互作用吸附在泡沫钛表面上，制成一种带有模拟酶的流动反应器用于降解白酒中DEHP。在本项工作中讨论了多肽的结构和催化活性、多肽与DEHP间的相互作用以及DEHP的水解机制，并研究了多肽修饰的泡沫钛流动反应器的稳定性和可重复使用性。
DEHP对人类健康造成严重威胁。它可通过皮肤接触、呼吸和饮水等途径进入人体，它的高亲脂性使其可以在脂肪组织中积累，加重毒性负担。长期低剂量接触还会导致肾脏、心脏等多系统毒性损伤，增加癌症风险。国家卫健委规定白酒中DEHP的允许限量为5 mg/kg。为降低污染风险，除了强化对原料和水源的质量控制，减少使用可能释放塑化剂的塑料制品以外，还可以通过后期处理去除白酒中残留的DEHP。因此开发一种安全、绿色的DEHP降解技术对于保护人类健康具有重要意义。
本项工作中设计并通过固相合成法合成了带有活性位点和发夹结构序列的六条多肽（表1），并将具有烯二醇结构的咖啡酸结合到多肽上。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪对合成后多肽分子量的分析确定成功合成这六条多肽。圆二色光谱分析结果显示，P1、P2和P6表现为无规则卷曲，而P3、P4和P5则展现出在β-转角和β-折叠共同作用下形成的β-发夹结构（图1）。
通过对这六条肽在模拟白酒环境中对DEHP的水解活性测定中发现，P1作为后续多肽序列设计的基础表现出良好的活性，对50ppm的DEHP溶液的水解率为55.66%，P2因其在序列中引入的丝氨酸活性位点，提高了活性。P3和P4由于催化三联体之间间距的增加以及引入色氨酸造成空间位阻的增大，其催化活性相较于P1有所降低。P5序列则是在每组催化三联体前增加了两个甘氨酸，形成了氧洞结构，这一结构降低了反应活化能，使得P5依然表现出较高的水解活性。P6则是由于其活性位点较少且空间位阻较大难以共同催化反应的进行（图2）。
分子对接模拟进一步揭示了这些多肽与DEHP之间的相互作用。具有β-发夹结构的P3、P4、P5这三条肽在与DEHP结合时，显示出了更高的结合能，并且在多肽与DEHP之间形成了稳定的氢键网络。
电子密度拉普拉斯函数研究发现，DEHP酯键附近的电子密度分布不均匀，为亲核攻击提供了方向（图3）。丝氨酸羟基攻击电子密度较低的碳原子，导致酯键断裂，实现DEHP的水解。这些分析不仅揭示了P5与DEHP的相互作用机制，还验证了亲核进攻的方向，可以更好地理解酶催化DEHP水解的反应机理。
通过扫描电子显微镜和元素能谱分析证实了多肽能够成功吸附到泡沫钛的多孔结构上且结合牢固（图4）。在DEHP降解反应后，大部分多肽仍稳定结合在泡沫钛表面，表明该反应器具有良好的稳定性。
经过简单的洗脱操作，泡沫钛表面的多肽可以被有效去除，泡沫钛上的碳、氮、氧这三种元素含量恢复至结合前水平，这也证明了这种反应器重复使用的便捷性（图5）。且双缩脲反应测定的结果表明，每克泡沫钛颗粒可吸附约2.76 mg多肽。因此，利用烯二醇结构与泡沫钛的吸附和洗脱操作，不仅可以较为简便的制备反应器，且具有良好的重复利用性，为反应器的研究提供了新方向。
筛选出具有较高活性的P1和P5这两条多肽，并对由这两条多肽制成的泡沫钛反应器水解活性的测试中发现，形成β-发夹结构的P5与只形成无规则卷曲结构的P1相比展现出更高水解活性和稳定性（图6）。随后，对P5在真实白酒样品中的测试证明了P5改性的泡沫钛反应器对水解DEHP的水解效率为34.84%，证实了其在环境更为复杂的实际样品中同样具有良好的水解活性。
本稳设计并合成了六条多肽来降解DEHP。这六条肽均含有丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸所组成的催化三联体，并添加了发夹结构序列。DEHP的降解结果表明其中P1、P2以及P5表现出良好的水解活性。此外，NCI和EDLF分析用于了解肽和DEHP之间的非共价相互作用，以及水解过程中亲核攻击的方向。随后利用咖啡酸成功将P1与P5这两条多肽结合到泡沫钛上制备了反应器。其中，由P5制成的反应器可以在白酒真实样品中实现对DEHP的水解，并具有良好的稳定性和重复利用性。这种反应器制备简便，重复使用操作便捷，为水解溶液中的DEHP提供了新的思路。
