第一作者：仲淑萍，袁骏华，牛勇
通讯作者：姜启晓
通讯单位：青岛大学公共卫生学院
论文DOI：10.1016/j.jhazmat.2024.134337
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成果简介
近日，青岛大学公共卫生学院姜启晓教授团队在Journal of Hazardous Materials上发表了题为“Persistent metabolic toxicities following developmental exposure to hexaffuoropropylene oxide trimer acid (HFPO-TA): Roles of peroxisome proliferator activated receptor gamma”的研究论文。本研究采用鸡胚染毒模型，利用气室注射及卵内慢病毒转染技术，揭示了在胚胎时期，暴露于HFPO-TA后会引起脂肪组织增生、肝脂肪变性、血清胰岛素及游离脂肪酸水平升高和胰岛肥大等表现的发育代谢毒性效应，其中PPARγ起到核心作用，补充HFPO-TA的毒理学信息，为人类的健康风险评估提供更全面的理论依据。
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六氟环氧丙烷三聚酸（Hexafluoropropylene oxide trimer acid，HFPO-TA）作为一种新型全氟辛酸替代品，能够诱导机体产生多种毒性效应。本研究利用鸡胚染毒模型，通过LC-MS/MS检测0月龄和3月龄雏鸡血清中HFPO-TA的暴露水平；通过H&E染色及油红O染色评估HFPO-TA暴露在0月龄和3月龄时引起的肝脏、脂肪、胰腺组织的病理学改变。同时以化学比色法比较血清中游离脂肪酸水平变化，以ELISA法比较血清胰岛素含量的变化，明确HFPO-TA暴露引起的发育代谢毒性效应。明确其毒性效应后，利用卵内慢病毒转染技术，阐明相关的毒性作用机制。首先，通过建立PPARγ报告基因系统，借助荧光动物成像仪及qRT-PCR确认HFPO-TA诱导卵内PPARγ的激活。其次，通过建立PPARγ在体沉默系统，利用H&E染色和油红O染色评估PPARγ沉默对HFPO-TA暴露诱导的各毒性终点的影响。此外，采用免疫组化和qRT-PCR方法探究PPARγ下游基因GPD1和FASN在脂肪组织中的表达水平，探索PPARγ在HFPO-TA诱导的发育代谢毒性效应中的作用。
引言
HFPO-TA作为新型PFOA替代品，在环境中广泛分布。目前在多个国家的地表水、饮用水、土壤、粉尘、野生动物、植物，乃至人体内均检测到了HFPO-TA。此外，多项研究证实，HFPO-TA暴露可诱导机体产生多种毒性作用，因此对于其暴露所带来的相关健康风险不容忽视。目前关于HFPO-TA暴露诱导的发育毒性研究，尤其是HFPO-TA发育暴露对脂质代谢的影响尚未见报道。因此，本研究利用鸡胚染毒模型，探索六氟环氧丙烷三聚酸（HFPO-TA）胚胎染毒诱导的发育代谢毒性作用，并通过慢病毒转染技术，揭示PPARγ在HFPO-TA暴露引起的发育代谢毒性中的作用，阐明相关的毒性作用机制，补充HFPO-TA的毒理学信息，为人类的健康风险评估提供更全面的理论依据。
图文导读
图1：0月龄雏鸡血清中HFPO-TA的暴露水平。
通过LC-MS/MS检测0月龄和3月龄雏鸡血清中HFPOTA的暴露水平发现，发育暴露0.5、1和2 mg/kg（蛋重）HFPO-TA，在0月龄雏鸡组血清中检测出HFPO-TA的含量分别为324 ± 41 ng/mL、888 ± 133 ng/mL和1747 ± 366 ng/mL。与相同剂量的PFOA暴露研究结果相比，数值略低，表明HFPO-TA生物累积性略低于PFOA。尽管如此，考虑到HFPO-TA的环境暴露水平（高达68.5 ug/L）及其生物蓄积性，其潜在的健康风险仍需引起注意。而3月龄雏鸡组血清中HFPO-TA浓度均低于检测限，未检测出HFPO-TA，表明此时HFPO-TA已从动物体内排出。
图2：HFPO-TA诱导卵内PPARγ的激活。
A：发育至 ED6 时各组鸡胚绿色荧光表达的代表性图像。B：胚胎总荧光强度的定量统计图。C：整体鸡胚组织中FABP4 mRNA表达水平。D：整体鸡胚组织中CD36 mRNA表达水平。
通过建立PPARγ报告基因系统，借助荧光动物成像仪以及qRT-PCR检测技术，探究HFPO-TA诱导卵内PPARγ激活的能力。研究发现，与已知的PPARγ激动剂罗格列酮相比，HFPO-TA的效力相对较弱，但与空白对照组相比，其确实能增强绿色荧光蛋白的表达，提示HFPO-TA具有直接激活卵内PPARγ的能力；此外，通过qRT-PCR检测发现，在发育暴露于HFPO-TA的整体鸡胚中PPARγ下游基因FABP4和CD36的表达显著增强，进一步证实了HFPO-TA能够诱导卵内PPARγ的激活。
图3：HFPO-TA发育暴露诱导的脂肪毒性和其他代谢效应。
A：0月龄或3月龄雏鸡脂肪组织H&E染色的代表性图片。B：0月龄或3月龄雏鸡胰腺组织H&E染色的代表性图片。C：0月龄雏鸡脂肪细胞大小的分析结果统计图。D：0月龄雏鸡胰岛面积的分析结果统计图。E：0月龄雏鸡血清中游离脂肪酸含量的测定结果。F：0月龄雏鸡血清中胰岛素含量的测定结果。G：3月龄雏鸡脂肪细胞大小的分析结果统计图。H：3 月龄雏鸡胰岛面积的分析结果统计图。I：3月龄雏鸡血清中游离脂肪酸含量的测定结果。J：3月龄雏鸡血清中胰岛素含量的测定结果。
图4：HFPO-TA暴露诱导发育性肝毒性作用。
A：0月龄或3月龄雏鸡肝脏组织油红O染色的代表性图像。B：0月龄雏鸡肝中脂肪酸沉积比例的分析结果统计图。C：3月龄雏鸡肝脏脂肪酸沉积比例的分析结果统计图。
通过组织病理学实验发现，在2 mg/kg HFPO-TA发育暴露后的0月龄雏鸡肝脏组织中，出现以肝脏脂滴减少为主要表现的发育性肝毒性作用；在脂肪组织及胰腺组织中，未观察到明显的组织病理学改变；同时，通过血清生化测定分析，未观察到血清中游离脂肪酸和胰岛素含量的显著改变。与之相对地，在3月龄雏鸡中发现，胚胎期1 mg/kg和2 mg/kg HFPO-TA的发育暴露会导致明显的脂肪组织增生，并伴有肝脏脂肪变性、胰岛面积增大、血清游离脂肪酸和胰岛素水平升高的变化，是常见的代谢综合征的前兆表现。而LC-MS/MS结果显示，此时HFPO-TA已从动物体内排出，而HFPO-TA暴露诱导的代谢效应仍持续存在，以上结果表明，在胚胎时期HFPO-TA的发育暴露能够诱导机体产生发育代谢毒性效应，且该效应于刚出生时并不明显，发育至一定程度后才变得显著，这提示我们HFPO-TA可能不是安全的PFOA替代品。
图5：PPARγ沉默对HFPO-TA诱导的脂肪毒性和其他代谢效应的影响。
A：0月或3月龄雏鸡脂肪组织H&E染色的代表性图像。B：0月龄或3月龄雏鸡胰腺组织H&E染色的代表性图像。C：0月龄雏鸡脂肪细胞面积大小的分析结果统计图。D：0月龄雏鸡胰岛面积的分析结果统计图。E：0月龄雏鸡血清中的游离脂肪酸含量测定结果。F：0月龄雏鸡血清中的胰岛素水平的测定结果。G：3月龄雏鸡脂肪细胞面积大小的分析结果统计图。H：3月龄雏鸡胰岛面积的分析结果统计图。I：3月龄雏鸡血清中的游离脂肪酸含量的测定结果。J：3月龄雏鸡血清中的胰岛素水平的测定结果。
图6：PPARγ沉默对HFPO-TA诱导的发育性肝毒性的作用。
A：0月龄或3月龄雏鸡肝脏组织油红O染色的代表性图像。B：0月龄鸡肝脏组织中脂肪酸沉积比例的分析结果统计图。C：3月龄雏鸡肝脏组织中脂肪酸沉积比例的分析结果统计图。
为探索PPARγ在HFPO-TA诱导的发育代谢毒性效应中的作用，利用卵内慢病毒介导的PPARγ沉默技术实现了PPARγ基因的在体沉默，对0月龄及3月龄雏鸡进行组织病理学和血清生化分析发现，在0月龄雏鸡组中，HFPO-TA和/或PPARγ沉默对脂肪细胞大小、胰岛面积、血清胰岛素或游离脂肪酸水平均未产生显著影响。在3月龄雏鸡中观察到，暴露于2 mg/kg HFPO-TA能够诱导明显的发育代谢毒性效应，而PPARγ沉默显著减轻了HFPO-TA诱导的相关发育代谢毒性效应，同时，PPARγ激动剂罗格列酮很好的模拟了HFPO-TA诱导的作用，两者的联合暴露亦导致了更明显的发育代谢毒性作用。
图7：脂肪组织中FASN mRNA的表达。
A：HFPO-TA发育暴露后0月龄雏鸡脂肪组织中FASN mRNA表达水平。B：HFPO-TA和/或PPARγ沉默处理后0月龄雏鸡脂肪组织中FASN mRNA表达水平。C：HFPO-TA发育暴露后3月龄雏鸡脂肪组织中FASN mRNA表达水平。D：HFPO-TA和/或PPARγ沉默处理后3月龄雏鸡脂肪组织中FASN mRNA表达水平。
图8：脂肪组织中GPD1的表达。
A：不同剂量HFPO-TA发育暴露后0月龄鸡或3月龄雏鸡脂肪组织免疫组化染色的代表性图像。B：HFPO-TA和/或PPARγ沉默处理后0月龄或3月龄雏鸡脂肪组织免疫组化染色的代表性图像。C：HFPO-TA发育暴露后0月龄雏鸡脂肪组织中GPD1表达的分析结果统计图。D：HFPO-TA发育暴露后3月龄雏鸡脂肪组织中GPD1表达的分析结果统计图。E：HFPO-TA和/或PPARγ沉默处理后0月龄雏鸡脂肪组织中GPD1表达的分析结果统计图。F：HFPO-TA和/或PPARγ沉默处理后3月龄雏鸡脂肪组织中GPD1表达的分析结果统计图。
另外，通过qRT-PCR和免疫组化实验发现，2 mg/kg HFPO-TA发育暴露后，在0月龄雏鸡的脂肪组织样本中，PPARγ下游基因GPD1和FASN的表达水平没有发生显著变化，而尽管在3月龄时动物体内已没有HFPO-TA的存在，此时间段脂肪组织中GPD1和FASN的表达水平却显著增加，PPARγ沉默能有效缓解该现象。以上结果提示，在胚胎时期，暴露于HFPO-TA后会引起持续性的发育代谢毒性效应，其中PPARγ起到核心作用。
小结
本研究通过鸡胚染毒模型，揭示了在胚胎时期，鸡胚发育暴露于HFPO-TA后，0月龄雏鸡出现以肝脏脂滴减少为主要表现的发育性肝毒性；而当雏鸡发育至3月龄后，观察到持久的代谢毒性，主要表现为脂肪组织增生、肝脂肪变性、血清胰岛素及游离脂肪酸水平升高和胰岛肥大。通过LC-MS/MS检测相同暴露剂量的HFPO-TA和PFOA发现，HFPO-TA的生物蓄积性略小于PFOA。此外，本研究首次发现鸡胚发育暴露HFPO-TA能够诱导卵内PPARγ的激活，且PPARγ是HFPO-TA暴露诱导的发育代谢毒性中的关键分子。
作者简介
第一作者：仲淑萍，青岛大学公共卫生学院，硕士研究生，研究方向为全氟辛酸及其替代物发育暴露诱导的毒性作用及机制研究，以第一作者/共同第一作者在Journal of Hazardous Materials、Ecotoxicology and Environmental Safety发表论文两篇。
邮箱：zhongshuping0221@163.com
通讯作者：姜启晓，青岛大学公共卫生学院教授，硕士生导师，卫生毒理学系副主任，主要从事环境毒理研究，包括可吸入污染物及全氟类物质/替代物毒理研究。与郑玉新教授合作，开发了独具特色的鸡胚毒理研究模型，能实现多种不同途径，包括生命极早期真实吸入的鸡胚发育染毒，以及发育过程中的卵内基因操作。主持国家自然科学基金面上，青年项目各一项，山东省自然科学基金面上项目一项，获国家发明专利授权两项。研究成果在Journal of Hazardous Materials, Environmental Pollution, Ecotoxicology and Environmental Safety等杂志上共发表SCI论文45篇，其中第一或通讯作者26篇，他引857次。
邮箱：jiangq@qdu.edu.cn
JHM家族期刊包括Journal of Hazardous Materials (JHM)，Journal of Hazardous Materials Letters (JHM Letters), 和Journal of Hazardous Materials Advances (JHMA)。三本期刊拥有相同的scope，侧重在环境危险物质的迁移，影响，检测，和去除。旗舰期刊JHM发表高水平科研和综述文章，JHM Letters完全开放获取，发表Letter-type科研和前沿综述文章（3000字限制，4副图/表），JHMA定位为中档开放获取期刊。
