近日，河南农业大学微生物酶工程团队青年教师裴亚欣在Journal of Hazardous Materials上发表了题为“Biodegradation and bioaugmentation of tetracycline by Providencia stuartii TX2: Performance, degradation pathway, genetic background, key enzymes, and application risk assessment”的研究论文。本研究从黑水虻幼虫（Black solider fly larvae，BSFL）肠道中分离出一种新的四环素（TC）降解细菌——Providencia stuartii TX2，实现了对不同环境中TC的高效去除，揭示了TX2在高浓度TC压力下的存活与降解机制，并评价了其在多种环境下的生物修复应用的潜力。该研究不仅为抗生素污染环境的生物修复提供新的菌种资源，并且为抗生素的生物降解机制提供了新的见解。
TC残留因其对生物体的有害影响而受到广泛关注。目前，现有已分离的大多数菌株，对TC的耐受性和降解效率较低，难以在高浓度TC环境（如：制药废水、抗生素菌渣、重度污染土壤等）中应用。因此，本研究选择从一种耐受高浓度TC的腐食性昆虫——BSFL的肠道中分离出新型高效TC降解菌，鉴定为Providencia stuartii TX2。TX2在48 h内对初始浓度为400 mg/L TC的降解率达到72.17%。采用超高液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用鉴定到27种产物，推测了三条生物降解途径。其中，途径II和途径III是两种全新途径。结合ECOSAR软件和圆盘扩散法进一步验证了TX2生物降解降低了TC的毒性。多组学联合分析，阐明了TX2对TC耐受和降解的三种机制：i)TC通过外排泵家族(MdtA、MdtB、Mate家族和Tet(B)等)被泵出细胞；ii)TC被降解酶降解，包括谷胱甘肽-S转移酶、加氧酶、酯酶、氧化还原酶、富马酰乙酸水解酶家族、超氧化物歧化酶等；iii)广谱性压力应激酶和抗菌药物抗性酶及在逆境下协助蛋白正确折叠的分子伴侣的作用。最后，探究了TX2在不同环境中的生物强化效果。结果表明，TX2不仅能有效去除不同环境中的TC，并且能够降低本身ARGs丰度较高样品中总ARGs和MGEs的发生率，而不会对ARGs丰度较低的样品中的总ARGs和MGEs的丰度带来扰动。该研究为抗生素的生物降解机制提供了新的见解，并为抗生素去除的生物强化技术提供了宝贵的微生物资源。
TC因在环境中残留引发的不利影响而受到广泛关注。目前，从不同环境中分离出的大多数菌株都难以降解高浓度的TC并在实际环境中应用。此外，前人对菌株的TC生物降解的研究主要集中在分离和表征TC降解微生物上，对TC降解机制和其产物毒性的表征较为有限。由于研究人员对细菌降解TC的确切机制缺乏共识，TC降解途径和相关基因也有待阐明。
本研究从黑水虻幼虫肠道中分离得到菌株TX2。该菌株能在含有1500 mg/L的TC的培养基中生长，并且在48 h内降解了400 mg/L的TC，降解率为72.17%。基于其形态特征、16S rRNA基因和全基因组的系统发育分析，将TX2鉴定为Providencia stuartii(图1和图S4)。
接种TX2组的TC降解率显著高于CK组(图2a)，二者差异主要归因于TX2的生物降解。此外，在整个降解过程中，菌株生长状况良好，溶液的pH从7.0增加到8.4(图2b)。pH升高的原因可能是细菌细胞在反应介质中分解蛋白胨，释放出氨、胺等碱性化合物，也可能是TC的降解导致碱性物质的生成。
通过研究初始温度、pH、接种量和初始TC浓度对TX2降解TC的影响，发现温度、pH对TC的生物降解有显著影响，在30℃和35℃下，TC的平均降解率分别达到62.51%和71.25%，显著高于20℃和25℃下的TC降解率(图3a)；在初始pH值5-9范围内，TC降解率分别为55.89%、57.14%、66%、62.55%和64.44%(图3b)，结果表明较高的温度(30-35℃)和中性至弱碱性的条件有助于TX2降解TC。TX2对TC的生物降解与初始细菌接种量呈正相关(图3c)。TX2对50-200 mg/L的TC降解率达到62.65-97.37%(图3d)，表明TX2对不同浓度的TC均有较高的降解效率。
共发现26种潜在的TC生物降解中间产物(图4)，结合已有的文献报道推测得到菌株TX2的TC降解途径如图所示(图4)，其中，途径II和途径III为全新的降解途径。为了评估TX2降解后TC代谢产物的生物毒性，进行了ECOSAR毒性预测，结果显示，菌株TX2的生物降解降低了TC对鱼类、绿藻、水蚤的毒性作用(图5a-b)；产物抑菌活性进一步证实，菌株TX2可以降低TC的生物毒性(图5c-d)。
全基因组测序结果显示，TX2菌株由一条环状染色体组成(图6a)，GC含量为41.14%。KEGG功能注释结果显示，与外源生物降解(31)、碳水化合物代谢(231)、抗菌药物抗性(47)相关的基因可能参与TC的降解(图6b)。在TX2染色体中共发现包括四环素类、大环内酯类、氟喹诺酮类等在内的10种主要的抗生素抗性基因(图7a)，其中TC抗性性的基因有20个，多重耐药基因43个(图7a-b)。此外，在TX2的基因组上检测到了漆酶和谷胱甘肽-S转移酶基因，这些基因的存在，是TX2降解TC的关键所在。在已知的六类TC降解酶中，只有GST在转录组水平上被检测到,表达量的上调倍数仅为1.97倍(表1)，然而，这并不足以解释TX2高效的TC降解能力。
因此，本研究联合多组学分析，阐明了TX2对TC抗性和降解的三种机制：i) TC通过外排泵家族(MdtA、MdtB、Mate家族和Tet(B)等)被泵出细胞；ii)TC被降解酶降解，包括谷胱甘肽-S转移酶、加氧酶、酯酶、氧化还原酶、富马酰乙酸水解酶家族、超氧化物歧化酶等；iii) 广谱性压力应激酶和抗菌药物抗性酶及在逆境下协助蛋白正确折叠的分子伴侣的作用。有趣的是，典型的核糖体保护机制蛋白质(伸长因子Tu和G等)的上调并不显著(图8)。此外，我们发现在TC压力下，大量未知功能的蛋白表达量上调。我们推测未知功能蛋白可能包含参与核糖体保护机制的新基因及其它新型降解酶基因。
与对照组相比，TX2组在鸡粪（CM）、土壤（SL）、水体（WW）和金霉素菌渣（CFR）中的TC或CTC的降解率分别提高了18.36%、21.63%、20.28%和32.05%(图9a)。此外，固定化的IMP-TX2能够在WW体系中至少稳定运行35天(5个循环)(图9b-c)。上述结果表明，TX2的加入显著促进了环境中四环素类抗生素的降解，尤其在处理含TC污染的废水中具有较高的应用潜力。
此外，为了进一步评估TX2应用的生态安全性，选择高四环素抗性基因（TRGs）丰度样品(CM)和低TRGs丰度样品(SL)，鉴定了8种TRGs(tetA、tetC、tetG、tetL、tetM、tetO、tetW和tetX)以及整合酶基因intI-1的水平在TX2生物强化前后的丰度。结果显示，在CM组中，TX2的生物强化后，上述基因丰度均呈现不同程度的降低；而在SL组中，添加TX2对TRGs丰度的影响较小(图10)。上述结果表明，TX2在初始TRGs水平高的环境中表现出更强的修复效果，而对初始低水平TRGs的环境中ARGs与MGEs丰度几乎没有产生扰动。这些发现强调了TX2在去除TC污染方面的应用潜力。
本研究从耐受高浓度TC的腐生昆虫BSFL的肠道中分离到一种新型高效TC降解细菌TX2，鉴定为Providencia stuartii。其在48小时内，可将初始浓度400 mg/L的TC有效降解72.17%。TX2通过异构、羟基化、氧合、开环和脱基团等过程，将TC代谢成27种潜在的降解产物，并显著降低了TC的毒性。多组学联合分析揭示了TX2降解TC的关键酶和机制。此外，其在高ARGs污染样品CM中的生物强化应用不仅能显著降低TC浓度，还能有效降低ARGs和MGEs的发生率。该研究为抗生素的生物降解机制提供了新的见解，并为抗生素去除的生物强化技术提供了宝贵的微生物资源。
