第一作者：李梦蝶
通讯作者：付林、赵卉、徐德祥
通讯单位：安徽医科大学第二附属医院
论文DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.134560
图文摘要
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成果简介
近日，安徽医科大学第二附属医院付林教授团队联合赵卉教授团队共同在在Journal of Hazardous Materials上发表了题为 “Benzo[a]pyrene evokes epithelial-mesenchymal
transition and pulmonary fibrosis through AhR-mediated Nrf2-p62 signaling”的研究论文。这项研究通过体内体外实验证实了亚慢性苯并[a]芘（BaP）暴露能够诱发小鼠肺泡上皮细胞上皮-间质转化（EMT）和肺间质纤维化，并揭示了AhR介导的Nrf2-p62信号通路在其中的驱动作用。全文速览
苯并[a]芘（BaP）及其代谢最终产物苯并[a]芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化物（BPDE）是已知的有毒环境污染物。本研究旨在分析亚慢性BPDE暴露是否引起肺纤维化及其潜在机制。在本研究中，通过吸入暴露，将C57BL/6J雄鼠置于BPDE中染毒 8周。我们的研究结果表明，亚慢性BPDE暴露诱发了小鼠肺泡上皮细胞（AEC2）上皮-间质转化（EMT）和肺纤维化。在体内和体外实验中发现BPDE暴露均促进了Snail的核易位。进一步的实验表明，Nrf2和p62在BPDE暴露的肺泡上皮细胞中表达上调。此外，Nrf2 siRNA转染明显减轻了BPDE诱导的p62的上调。此外，p62
shRNA抑制了BPDE引起的Snail核易位和EMT。从机制上来说，BPDE促进了p62与Snail在核内的物理相互作用，然后通过p62依赖的自噬-溶酶体途径抑制Snail蛋白降解，最终上调Snail的转录活性。此外，BPDE处理的肺泡上皮细胞中芳烃受体（AhR）在肺泡上皮细胞中被激活。双荧光素酶报告基因结果表明，激活的AhR可与Nrf2基因启动子结合。此外， CH223191或AhR拮抗剂α-萘黄酮（α-NF）的预处理能够抑制BPDE激活的Nrf2-p62信号通路，减轻BPDE诱导的小鼠EMT和肺纤维化。综上所述，BaP通过AhR介导的Nrf2-p62信号通路诱导肺泡上皮细胞发生EMT和肺纤维化。引言
BaP及其代谢最终产物BPDE是多环芳烃中的典型代表物，也是已知的有毒环境污染物和人类致癌物。研究表明，BaP暴露与多种肺部疾病密切相关。然而，几乎没有证据表明BaP暴露与肺纤维化之间的联系。我们的研究发现，BaP暴露能够通过上皮-间质转化（EMT）诱发肺间质纤维化。BaP暴露通过AhR介导的Nrf2-p62信号激活引起Snail核转位，进而诱导EMT。因此，AhR拮抗剂可能是BaP诱导的EMT和肺纤维化的一种潜在的预防和治疗策略。图文导读
图1：亚慢性BPDE暴露诱导小鼠肺和肺泡上皮细胞发生纤维化。
研究人员分析了亚慢性BPDE暴露对小鼠肺纤维化的影响。体内实验发现BPDE暴露显著增加了肺重量和肺系数，但没有影响小鼠体重（图1A-1C)。此外BPDE暴露的小鼠出现了肺泡结构损伤、肺泡壁增厚和局灶性纤维灶，评估其肺病理评分明显升高（图1D）。而且BPDE暴露组小鼠出现肺泡间隔炎性细胞浸润，病理学评分增高（图1E和1F）。随后进行纤维化程度评估，结果表明BPDE组小鼠肺组织中胶原纤维和α-SMA表达增高，且肺纤维化评分较对照组明显升高（图1G，1H，1L，1M和1O-1Q）。此外，BPDE暴露降低了小鼠肺顺应性，增加了气道阻力（图1I-1K）。在进行的体外实验中得到了类似的结果，BPDE暴露后，MLE-12细胞的α-SMA和Col1A1表达增加（图1R-1U）。图2：亚慢性BPDE暴露诱导小鼠肺和肺泡上皮细胞发生EMT。
研究者在小鼠肺组织及AEC2细胞中评估了亚慢性BPDE暴露对EMT的影响。体内和体外实验中均发现，BPDE暴露组小鼠肺组织和MLE-12细胞中上皮细胞标志物E-Cadherin表达下降，而间质细胞标志物N-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平升高（图2A-2H）。![]()
图3：亚慢性BPDE暴露诱导小鼠肺及肺泡上皮细胞中EMT-TFs激活。
研究人员通过体内和体外实验检测了BPDE对小鼠肺泡上皮细胞中EMT-TFs的影响。体内实验表明，BPDE暴露组小鼠AEC2细胞中Snail和Twist蛋白表达水平升高（图3A-3C）。体外实验得出相似结果，免疫荧光检测发现BPDE暴露后，MLE-12细胞中Snail和Twist表达增加（图3E和3F）。![]()
图4：在肺泡上皮细胞中，BPDE暴露激活了Nrf2-p62信号通路。
该研究发现，BPDE暴露可以上调MLE-12细胞中Nrf2和下游靶蛋白HO-1表达，同时上调了p62的表达水平（图4A-4F）。随后进行Nrf2敲低，选定敲低效率最高的Nrf2 siRNA-1片段进行转染，结果发现Nrf2沉默能够部分减轻由BPDE暴露引起的p62水平的升高（图4G-4K）。![]()
图5：BPDE通过促进肺泡上皮细胞中p62与Snail的相互作用来抑制Snail蛋白降解。
为了验证p62对EMT和EMT-TFs的影响，研究人员使用p62 shRNA进行干预。结果发现，p62沉默后能够减轻由BPDE暴露所诱发的Snail激活（图5A-5C）。同时，p62的沉默逆转了BPDE暴露引起的E-Cadherin的降低和N-Cadherin的升高（图5D-5F）。进一步检测了Snail和p62之间的相互作用。Co-IP结果表明，BPDE暴露后，Snail和p62之间的相互作用在细胞质中有所减弱，反而在细胞核内增强（图5G和5H），免疫荧光结果支持BPDE暴露增加核内Snail和p62的共定位（图5I）。为了评估Snail蛋白表达升高可能的原因，研究人员首先分析了Snail的稳定性。结果发现，BPDE暴露显著降低了Snail蛋白的降解，且Snail蛋白降解可能通过自噬-溶酶体途径进行降解（图5J-5N）。随后研究人员利用p62 shRNA进行干预，深入探究p62在Snail蛋白降解中发挥的作用。结果发现，p62的缺失明显降低了Snail蛋白稳定性，而p62
shRNA显著降低了BafA1引起的Snail的升高（图5P-5S）。
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图6：BPDE暴露通过肺泡上皮细胞中AhR依赖的方式激活Nrf2-p62信号通路。
研究发现，BPDE暴露能够激活AhR及其下游通路（图6A-6F）。为了探索AhR在BPDE激活的Nrf2-p62信号通路中的作用，研究人员进行了双荧光素酶报告基因检测。首先预测了AhR在Nrf2启动子上的4个潜在结合位点，并构建了双荧光素酶报告载体。结果表明NRF2突变启动子载体（MUT1和MUT2）和AHR质粒对NRF2启动子的荧光素酶活性没有明显的影响（图6G和6H）。而后在体外实验给予AhR抑制剂CH223191共培养，结果发现CH223191能够显著降低BPDE所引起的AhR，Nrf2和p62增高的蛋白表达水平（图6I-6L）。体内实验中给予AhR特异性拮抗剂α-萘黄酮干预，结果发现α-萘黄酮明显抑制了BPDE暴露组小鼠肺组织中AhR和Nrf2、p62表达水平的升高（图6M-6Q）。![]()
图7：AhR拮抗剂可减轻BPDE诱导的EMT和肺纤维化。
研究人员评估了α-萘黄酮对BPDE诱导的小鼠EMT和肺纤维化的影响。α-萘黄酮预处理对BPDE所引起的小鼠体重、肺重、肺系数的改变没有明显影响（图7A-7C）。α-萘黄酮预处理减轻了BPDE所导致的小鼠肺损伤和炎性细胞浸润（图7D-7G）。此外，α-萘黄酮预处理改善了BPDE诱导的小鼠肺组织胶原纤维沉积、肺纤维化评分和肺组织中羟脯氨酸含量（图7H-7J）。α-萘黄酮预处理逆转了BPDE引起的小鼠肺功能的下降（图7K-7M）。最后，α-萘黄酮预处理显著提高了BPDE引发的肺组织中降低E-Cadherin蛋白表达，同时抑制了其下降的N-Cadherin、Vimentin和α-SMA的蛋白表达水平（图7N-7R）。小结
BaP是一种具有代表性的环境空气中多环芳烃的环境污染物。在本研究中，研究人员分别关注了BaP代谢终产物BPDE暴露对体内和体外EMT和肺纤维化的影响。研究结果表明，AhR介导的Nrf2-p62信号通路被认为是BPDE诱导的EMT和肺纤维化的驱动因素。研究中主要发现如下： (1)亚慢性BPDE暴露诱导小鼠肺纤维化；(2)亚慢性BPDE暴露诱发小鼠肺和肺泡上皮细胞EMT；(3) BPDE暴露激活肺泡上皮细胞中的Nrf2-p62信号；(4) BPDE暴露增加了肺泡上皮细胞中AhR与Nrf2启动子的结合；(5)
BPDE暴露通过促进肺泡上皮细胞中Snail与p62的相互作用，提高了Snail核易位和稳定性；(6)
AhR拮抗剂抑制了BPDE诱导的EMT和肺纤维化。作者介绍
第一作者：李梦蝶，博士研究生，单位：安徽医科大学第二附属医院。
邮箱：xiaomengli66@126.com
通讯作者：付林，副教授，硕士生导师，单位：安徽医科大学第二附属医院。
邮箱：fulindev@126.com
通讯作者：赵卉，教授，博士生导师，单位：安徽医科大学第二附属医院。
邮箱：zhaohuichenxi@126.com
通讯作者：徐德祥，教授，博士生导师，单位：安徽医科大学。
邮箱：xudex@126.com
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JHM家族期刊包括Journal of Hazardous Materials (JHM)，Journal
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