![]()
通讯作者：舒龙飞
通讯单位：中山大学环境科学与工程学院
https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.134958图文摘要
近日，中山大学环境科学与工程学院舒龙飞课题组在学术期刊Journal of Hazardous Materials上发表了题为“Nano- and microplastics drive the dynamic equilibrium of amoeba-associated bacteria and antibiotic resistance genes”的研究论文。文章主要探究了不同粒径和不同浓度的聚苯乙烯微纳米塑料对阿米巴-细菌共生系统及相关抗性基因的影响。结果表明，纳米塑料和微塑料破坏了阿米巴和细菌之间共生关系的初始平衡，对宿主阿米巴的生长发育产生不利影响。此外，纳米塑料和微塑料增加了宿主阿米巴孢子内抗生素抗性基因和重金属抗性基因的相对丰度。本研究揭示了阿米巴-细菌共生系统对聚苯乙烯微纳米塑料的响应机制，为环境污染下的微生物共生互作研究提供了新的视角和理论依据。并且，研究结果强调了微塑料污染对共生系统中病原菌和抗性基因在环境中传播的潜在风险。
环境污染不仅对人类健康和生态环境安全构成严重威胁，而且对环境微生物产生深远影响，这种影响可能会破坏微生物群落的平衡和功能。作为一种新型环境污染物，微塑料在全球范围内普遍存在，由于其对环境、动物和人类健康的潜在不利影响，已成为全球公认的环境污染问题。然而，微塑料对原生生物和细菌之间相互作用的影响仍知之甚少。阿米巴是原生生物的主要类群，在环境中分布广泛。伯克氏菌Paraburkholderia agricolaris和Paraburkholderia hayleyell是与土壤阿米巴Dictyostelium discoideum相关的两个常见的共生物种，它们对宿主表现出不同的感染模式。寄生共生体P. hayleyella对宿主阿米巴最为有害，而有益共生体P. agricolalis对宿主阿米巴的抑制作用较小。P. agricolaris更接近环境微生物与阿米巴之间的共生关系，而P. hayleyella更接近病原体与阿米巴的寄生共生关系。阿米巴-细菌相互作用为我们解决上述问题提供了一个简单易处理的共生系统模型，并且这种相互作用在环境中广泛存在并时刻发生。因此，本研究旨在揭示纳米塑料和微塑料胁迫对阿米巴-细菌共生体系及相关抗性基因的影响及其机制。这项研究为微塑料如何与微生物共生系统之间相互作用，以及为生态环境健康风险评估系统的完善提供了新的见解。通过测定对照组和聚苯乙烯塑料暴露处理组中宿主阿米巴孢子数，发现聚苯乙烯塑料暴露对阿米巴的生长发育有不利的影响（图1-2）。在有益共生体系和寄生共生体系统中，阿米巴产孢子量随着聚苯乙烯塑料粒径的减小而显著降低，并且粒径主效应显著（GLM，P<0.01）。与微塑料相比，纳米塑料（20 nm和100 nm）暴露对阿米巴适应性的影响更严重。20 nm、100 nm、1000 nm和5000 nm聚苯乙烯微球暴露下，阿米巴总孢子量分别下降了21.17%~54.76%、15.14%~40.33%、10.16%~22.73%和1.1%~15.38%。此外，随着聚苯乙烯塑料暴露浓度的增加，阿米巴孢子总数也逐渐减少。以上结果表明，在阿米巴-细菌共生系统中，宿主阿米巴对纳米塑料更敏感，并且阿米巴总孢子量对纳米塑料浓度表现出剂量效应。图1 实验设计。（A）阿米巴-细菌共生体系构建和微塑料暴露实验设计。（B）共生体系在荧光显微镜下成像。共生体细菌Paraburkholderia agricolaris用红色荧光标记，Paraburkholderia hayleyella用绿色荧光标记。
图2 纳米塑料和微塑料对有益共生体（A）和寄生共生体（B）中宿主阿米巴孢子数的影响。根据Fisher’s LSD检验，不同的小写字母代表因子水平之间的显著差异（p<0.05）。
以共生体细菌为研究对象，评估了聚苯乙烯微纳米塑料暴露下宿主阿米巴对细菌的吞噬能力（图3）。对阿米巴体内荧光标记细菌进行了定量分析，结果发现，在有益和寄生共生系统中，聚苯乙烯微纳米塑料粒径对阿米巴孢子内共生细菌的荧光强度有显著影响。在对照组中，寄生共生系统中共生细菌的荧光强度（1.45~1.69）超过了有益共生系统中的荧光强度（0.80~1.10）。聚苯乙烯微纳米塑料暴露减弱了这两种共生系统携带内生菌数量的差异，特别是在微塑料（1000 nm和5000 nm）暴露条件下。在有益共生体系统中，暴露于微塑料的内生菌的荧光强度（0.82~1.65）超过了暴露于纳米塑料的内生菌的荧光强度（0.62~1.49）。寄生共生体系统中，与对照组和其他三种粒径处理组相比，5000 nm微塑料暴露下的阿米巴孢子内细菌荧光强度更高。此外，微塑料粒径和浓度的交互作用显著影响了阿米巴-细菌共生系统中的内共生体（GLM，P<0.05）。这些结果表明，纳米塑料和微塑料暴露会干扰宿主阿米巴对细菌的吞噬，与纳米塑料相比，微塑料胁迫会增强共生体细菌对宿主阿米巴的定殖。图3 纳米塑料和微塑料对阿米巴-细菌共生体系的宿主阿米巴孢子内共生体荧光强度的影响
（3）聚苯乙烯微纳米塑料暴露下阿米巴-细菌共生体系的命运为了深入探讨聚苯乙烯微纳米塑料对阿米巴与细菌之间互作的影响，进一步评估了被共生体细菌定殖的阿米巴孢子占总孢子数的比例（图4）。纳米塑料暴露下携带细菌的阿米巴孢子比例显著增加（P<0.05）。寄生共生系统中携带细菌的阿米巴孢子比例（66.21%~85.94%）总体上高于有益共生系统（42.25%~48.88%）。此外，与有益共生系统相比，聚苯乙烯微纳米塑料的粒径对寄生共生系统中携带细菌的阿米巴比例有显著影响（P<0.01）。纳米塑料和微塑料暴露整体上增加了携带细菌的阿米巴孢子的比例。此外，聚苯乙烯微纳米塑料浓度对荧光阿米巴孢子比例也有显著影响（GLM，P<0.05）。随着纳米和微塑料浓度的增加，有益共生系统中荧光孢子比例增加，而寄生共生系统中荧光孢子比例呈现先上升后下降的趋势。以上表明，寄生共生系统中宿主与共生体之间具有更密切和必要的联系，宿主阿米巴携带共生体细菌的比例更高。接触纳米塑料和微塑料会增加阿米巴携带细菌的可能性，并且，纳米塑料会产生更明显的剂量效应。总之，聚苯乙烯微纳米塑料对阿米巴与细菌相互作用的影响不仅体现在共生体细菌感染宿主阿米巴的强度上，还体现在广度上。![]()
图4 纳米塑料和微塑料暴露下阿米巴-细菌共生系统中荧光阿米巴孢子的比例。（A）来自有益共生体和寄生共生体系统的阿米巴孢子的倒置荧光显微镜成像。（B）不同浓度纳米/微塑料暴露下阿米巴-细菌共生系统中携带细菌的阿米巴孢子的比例。CK代表对照组，A、B、C、D、E和F分别代表暴露浓度为10、50、100、500、1000和2500 mg/kg。
（4）聚苯乙烯微纳米塑料增加了宿主阿米巴孢子内抗性基因相对丰度对宿主阿米巴孢子内抗性基因进行定量检测（图5），结果表明，暴露于聚苯乙烯微纳米塑料后，阿米巴孢子携带的抗生素抗性基因和金属抗性基因的相对丰度显著增加（P<0.05）。在有益共生系统中检测到6种抗性基因，其中sul1的相对丰度最高（1.29×10-4拷贝/16S rRNA拷贝），在寄生共生系统中检测到10种抗性基因，其中copA相对丰度最高（4.15×10-4拷贝/16S rRNA拷贝）（图5A）。聚苯乙烯微纳米塑料暴露提高了阿米巴-细菌共生系统中抗性基因相对丰度，其中20 nm纳米塑料作用下最突出。此外，聚苯乙烯微纳米塑料的粒径和浓度之间的交互作用对阿米巴-细菌共生体系中抗性基因的丰度也有显著效应（GLM，P<0.05）。有益和寄生共生系统中抗性基因对聚苯乙烯微纳米塑料暴露浓度的响应存在差异。随着暴露浓度的增加，有益共生系统中抗性基因的相对丰度在纳米塑料（20 nm）暴露下呈下降趋势，在微塑料（1000 nm）暴露下呈上升趋势。而寄生共生体系统中抗性基因的相对丰度在20 nm和1000 nm暴露下均呈增加趋势。以上结果强调，暴露于聚苯乙烯微纳米塑料会增加阿米巴-细菌共生系统中抗生素抗性基因和金属抗性基因的丰度，并且，抗性基因丰度的变化与共生系统的类型、微塑料的粒径和浓度有着复杂的联系。未来的研究还需要利用更多的测序手段进一步探究聚苯乙烯微纳米塑料暴露下阿米巴-细菌共生系统中基因层面的响应调控机制。 图5 纳米塑料和微塑料暴露下阿米巴-细菌共生体系中抗性基因相对丰度。（A）不同粒径和不同浓度的纳/微塑料暴露下两个共生体系中抗性基因相对丰度的热图。20、100、1000、5000分别表示塑料的粒径（nm），A、B、C、D、E、F分别表示暴露浓度为10、50、100、500、1000和2500 mg/kg。（B）纳/微塑料暴露下阿米巴-细菌共生系统中抗生素抗性基因（ARGs）和金属抗性基因（MRGs）的总相对丰度。
（5）聚苯乙烯微纳米塑料对阿米巴-细菌共生系统中抗性基因的驱动机制使用结构方程模型（SEM）和相关性网络分析，旨在阐明暴露于聚苯乙烯微纳米塑料下阿米巴-细菌共生系统中抗生素抗性基因（ARGs）和重金属抗性基因（MRGs）丰度变化的主要驱动因素（图6）。结果发现，聚苯乙烯微纳米塑料的粒径与阿米巴孢子量和孢内荧光强度呈显著正相关（r=0.48~0.75，P<0.01），浓度与阿米巴孢子量呈显著负相关（r=-0.26~0.30，P<0.05）。SEM还表明，聚苯乙烯微纳米塑料的粒径是MRGs的最显著预测因子，在有益共生体系中表现出显著的负相关（r=-0.49，P<0.05），在寄生共生体中表现出显著的正相关（r=0.28，P<0.05）。但浓度与抗性组成的相关性不显著。在有益共生体系中，阿米巴孢子总数（r=0.30，P<0.05）和阿米巴孢子内细菌荧光强度（r=-0.20，P<0.05）也显著影响MRGs。寄生共生体中，阿米巴孢子总数对ARGs有显著影响（r=-0.28，P<0.05），荧光孢子占比对MRGs有显著影响（r=-0.22，P<0.05）。相关性线型在20 nm暴露组（有益共生体（35），寄生共生体（74））中最多，共生系统及抗性基因之间存在更密切的相互作用，在5000 nm暴露组（有益共生体（21），寄生共生体（41））中最少。这与20 nm暴露下抗性基因丰度最高一致。我们推测，阿米巴-细菌共生系统中抗性基因丰度不仅伴随细菌增殖而增加，还可能通过基因转移来增加。
此外，在有益共生体系统中，intI1与MRGs（arsB、czcA、copA）和ARGs （FOX、sul1、tetA）呈显著正相关（P<0.001）。在寄生共生体中，intI1与MRGs （arsB、copA）和ARGs（FOX、MOX、sul1、sul2、tetA、tetG、tetM、tetR）呈显著正相关（P<0.05）。这也强调了聚苯乙烯微纳米暴露大大增加了耐药性基因在阿米巴-细菌共生系统内和生态环境中的传播风险。图6 有益共生体系（A）和寄生共生体系（B）中抗生素抗性基因（ARGs）和重金属抗性基因（MRGs）的结构方程模型分析。实线表示变量之间存在显著的正（红色）或负（蓝色）相关关系，虚线表示没有显著相关性。旁边的数字表示相关性系数。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
作为新型污染物，微塑料已在全球范围内普遍存在，对生态环境造成严重危害。然而，这些微塑料对原生生物和细菌之间相互作用及相关抗性基因的影响仍知之甚少。在这项研究中，我们探索了不同粒径和浓度的聚苯乙烯塑料对阿米巴-细菌共生系统的影响及机制。结果表明，聚苯乙烯塑料对宿主阿米巴的生长发育产生不利影响，并且与聚苯乙烯塑料粒径和浓度有关。此外，聚苯乙烯微纳米塑料破坏了阿米巴和细菌共生关系的初始平衡，干扰了共生体细菌在宿主阿米巴宿主体内的定殖能力。此外，聚苯乙烯微纳米塑料暴露增加了宿主阿米巴孢子内抗生素抗性基因和重金属抗性基因的相对丰度，这增加了人类病原体和抗性基因在环境中的潜在传播风险。本研究结果为微塑料与微生物共生系统之间的相互作用，以及生态环境和人类健康的风险评估系统提供了新的视角。舒龙飞，湖北黄冈人，中山大学逸仙学者，副教授，博士生导师，广东省杰出青年基金、美国生命科学基金获得者。以环境中主要原生生物阿米巴为例，围绕其研究方法、环境生态功能和健康风险展开系统研究，建立了一套环境原生生物研究模式系统。主持广东省杰出青年基金、国家基金委面上、青年项目、美国生命科学基金会、欧洲进化学会、中山大学青年拔尖科研人才培育项目等10余项国内外项目。发表SCI论文70余篇，以一作/通讯在生态（ISME J.，eLife，Mol. Ecol.，Funct. Ecol.）与环境（Environ. Sci. Technol.，Water Res.）领域的重要学术期刊发表论文。周敏，中山大学环境科学与工程学院在读博士生，主要研究方向为原生生物阿米巴捕食介导的抗生素抗性基因赋存及迁移机制，以第一作者或共同作者在Journal of Hazardous Materials，The ISME Journal，Environmental Science & Technology，Science of the Total Environment等期刊发表文章。
