近日，安徽师范大学刘洪明副教授团队联合上海农业科学院孙丽娜副研究员在环境领域著名学术期刊Journal of Hazardous Materials上发表了题为“Novel 4-chlorophenoxyacetate dioxygenase-mediated phenoxyalkanoic acid herbicides initial catabolism in Cupriavidus sp. DL-D2”的研究论文。本研究从工业活性污泥中分离得到一株能高效降解4-氯苯氧乙酸（4-CPA）并能以其作为唯一碳源生长的菌株Cupriavidus sp. DL-D2，利用基因组学、基因敲除与回补、酶学分析和气相质谱等实验技术方法，在分子水平上揭示了4-CPA的降解机制。
氯苯氧乙酸类除草剂被世界卫生组织(WHO)列为中等毒性物质。目前已报道的降解酶代谢途径均为促进苯氧乙酸（PAA）类除草剂底物发生单氧化反应进而降解，PAA类除草剂生成双氧化产物的相关分子机理尚不清楚。本研究从工业活性污泥中分离出了一株新的革兰氏阴性降解菌Cupriavidus sp.DL-D2，该菌能够在24小时内完全降解50 mg/L的4-CPA。本研究发现cpdAB基因编码的Iα型非血红素铁双加氧酶是降解PAA类除草剂的关键基因。这进一步加深了人们对非血红素铁双加氧酶在不同环境和微生物系统中的分布和多样性的了解，也表现出该类双加氧酶系统在生物降解和生物修复方面蕴藏着的巨大潜力。本研究证实了第四类能够降解PAA类除草剂的酶的存在，同时为其他类似芳香族化合物污染的微生物降解研究提供新的思路。
由于氯苯氧乙酸类除草剂在农业上的广泛应用，地下水和地表水中均检测到了高剂量的农药残留。微生物是消除环境中PAA类除草剂的关键因素，目前研究已分离出大量能降解4-CPA、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和2-甲基-4氯苯氧乙酸（MCPA）的微生物菌株。但报道的降解酶均为促使PAA底物单氧化反应后再进入下一步代谢途径，直接生成双氧化产物的相关分子机理有待阐明。
起初我们推测菌株DL-D2降解4-CPA的代谢产物可能是4-氯苯酚（4-CP）、4-氯邻苯二酚（4-CC），然后是芳环断裂。但我们分别以4-CP和4-CC作为唯一碳源培养菌株DL-D2时，以4-CC为底物的菌株DL-D2的OD600从0.1升高到0.267（菌株DL-D2能够快速降解4-CC），而4-CP没有降解，表明存在一条新的4-CPA降解途径。于是我们推测菌株DL-D2将4-CPA直接降解为4-CC，即存在双加氧酶参与。通过基因组分析在cpdC的上游和下游基因中寻找可能参与4-CPA降解的基因，发现两个上游基因orf5958-orf5959（cpdAB）（注释为双加氧酶及其还原酶）可能负责4-CPA的初始代谢。下游基因如orf5963（cpdD）等，可能编码用于降解4-CC下游代谢物的蛋白质。该基因簇包含九个基因：cpdA，cpdB，cpdC，cpdD，cpdE，cpdF和orf1-3，命名为cpd基因簇。cpdD、cpdE、cpdF三个基因分别编码降解4-CC环裂解产物3-氯戊二酸环化异构酶、二烯内酯水解酶和马来乙酸还原酶，最终生成TCA循环物质琥珀酸和乙酰辅酶A。
为了证实cpdAB在4-CPA降解中的作用，我们在菌株DL-D2的基因组中通过同源重组产生敲除突变株DL-D2ΔcpdAB。然后，将敲除突变体接种到MSM培养基中，用全细胞催化的方法验证4-CPA及其中间代谢物4-CP和4-CC的利用情况。同时采用质粒pBBR1MCS-2进行基因回补实验，将cpdAB基因的PCR产物与EcoRI和HindIII酶切的线性质粒pBBR1MCS-2融合，构建重组质粒pBBR-cpdAB，再电转入大肠杆菌DH5α中，提取质粒并转化到受体菌株DL-D2ΔcpdAB中，获得回补菌株DL-D2ΔcpdAB(pBBR-cpdAB)。
结果显示，突变体DL-D2ΔcpdAB无法利用4-CPA作为唯一碳源生长(图A-B)，这表明cpdAB基因簇在菌株DL-D2降解4-CPA中起着至关重要的作用。回补菌株DL-D2ΔcpdAB(pBBR-cpdAB)则恢复正常生长。突变菌株仍然能够利用中间产物4-CC，这表明cpdAB编码了负责催化4-CPA降解途径初始步骤的双加氧酶(图D)。
图A显示了13种还原酶的组织，揭示了包含三个结合结构域的保守区域的不同构型。这种构型归因于这些还原酶中三种不同结构域的交替组合。因此，cpdA和cpdB被认为编码一种双组分双加氧酶，启动4-CPA分解代谢途径。CpdA和CpdB以及相关双加氧酶的系统发育分析表明，CpdA和CpdB与这些典型的双加氧酶具有较低的进化关系(图B-C)。非血红素铁加氧酶系统都有一个典型的Rieske[2Fe-2S]型铁硫中心，在该类蛋白质中，Fe1由两个组氨酸配位，Fe2由两个半胱氨酸配位。
CpdB是CpdAB双加氧酶系统的典型末端加氧酶亚单位。与一些三组分双加氧酶或大小亚基的末端加氧酶不同，CpdAB是一种双组分双加氧酶。末端加氧酶的大亚基决定了底物特异性，CpdAB末端加氧酶组分的单亚基结构表明CpdB含有底物识别位点。
cpdAB基因簇的功能也在大肠杆菌细胞中得到验证。将cpdA、cpdB和cpdA/cpdB基因与pET28a结合构建重组载体，并分别在大肠杆菌中表达。用紫外光谱和HPLC每小时取样分析这些重组E.coil BL21(DE3)菌株代谢4-CPA的能力。如图4所示，全细胞催化实验显示携带pET28a-cpdAB质粒的E.coil BL21(DE3)细胞能够在8小时内将4-CPA转化为4-CC，证明了4-CPA的减少和4-CC的增加。在携带pET28a-cpdAB质粒的重组菌株E.coil BL21(DE3)中观察到底物特征性吸收峰(275 nm)降低。然而，当cpdA基因或cpdB基因在大肠杆菌中单独表达时，细胞不能降解4-CPA。通过上述实验，我们鉴定了两种Cpd蛋白，即CpdA(推测的还原酶)和CpdB(推测的双加氧酶)，它们对于4-CPA的双加氧作用是必需的。
用携带cpdAB基因簇的E.coil BL21(DE3)细胞鉴定CpdAB双加氧酶系统氧化4-CPA的反应产物。产物通过乙酸酐衍生化后，用二氯甲烷提取，利用GC-MS进行检测。衍生产物在m/z 227.9处显示分子离子峰，特征碎片离子分别为185.9 m/z(失去-COCH3)和143.9 m/z(失去两个-COCH3)(图5，D)。4-CPA的氧化产物被鉴定为4-CC的衍生产物(图5)，可以认为，CpdAB双加氧酶的真正产物实际上是4-CC。
除DL-D2外，NCBI数据库中尚未发现其他贪铜菌属菌株中存在cpd基因簇。相反，cpd基因簇在α-、β-和γ-变形菌门、氯氟菌门、厚壁菌门和放线菌门中被鉴定出来，包括26个属的43株菌株，这表明cpd基因簇在这些细菌中的基因结构具有高度的多样性(图6)。通常情况下，cpdA和cpdB基因是相邻或靠近的，但在Pseudacidovorax、Halalkalibacterium和Acidobacteriia菌株中，这两个基因位于较远的距离。只有3株菌株(Paraburkholderia sp. BL17N1、Paraburkholderia sp. BL6669N2和菌株DLD2)的cpd基因簇在一起，其他菌株的cpd基因簇分布较为分散，尤其是Rhodospirillaceae菌株的5个功能基因分布相对较远。大多数菌株的cpdA都大于1 kb，但在Variovorax、Rhodospirillaceae、Firmicutes和acidobacteria等菌株中，cpdA的大小仅为0.8 kb，说明功能基因具有遗传多样性。有趣的是，cpdA和cpdB的转录方向一致，这表明这两个基因可能共转录并翻译成蛋白质，协同执行双加氧反应的功能。
为了确定菌株 Cupriavidus sp. DL-D2中cpd基因簇的表达是否可诱导，通过实时定量PCR（RT-qPCR）测量了菌株DL-D2在4-CPA诱导和非诱导条件下的相对变化。根据RT-qPCR数据，与富马酸对照相比，4-CPA增加了cpdA、cpdB、cpdC、cpdD、cpdE和cpdF的表达。六个基因的相对表达倍数变化分别为16.4、18.2、100.4、24.5、29.7和8.1（图7）。数据表明cpd基因簇的表达受到诱导。
