第一作者：符振强
通讯作者：韩凤禄博士、李二超教授
通讯单位：海南大学、华东师范大学
论文DOI：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.133930
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成果简介
海南大学韩凤禄博士联合华东师范大学李二超教授课题组在Journal of Hazardous Materials上发表了题为“Dinotefuran exposure alters Biochemical, Metabolomic, Gut microbiome, and Growth responses in Decapoda Pacific white shrimp Penaeus vannamei”的研究论文。本研究以海洋甲壳动物凡纳滨对虾为研究对象，全面、系统地探究了水环境中的新烟碱类杀虫剂呋虫胺对凡纳滨对虾的毒性效应与机制，构建了凡纳滨对虾受呋虫胺胁迫下的生物反应网络。研究揭示了呋虫胺对凡纳滨对虾生理、生化、肠道菌群和代谢物的影响，尤其是其在导致氧化应激和代谢途径干扰方面的作用。此外，通过加权相关网络分析（WGCNA）识别了关键代谢物和肠道菌群之间的相互作用，为呋虫胺的生物效应及其环境风险评估提供了重要的分子水平证据。研究旨在为未来研究甲壳类动物对新烟碱类农药的特异性反应提供参考数据集，并为进一步评估呋虫胺的生物风险和识别潜在生物标记物指明方向。
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本研究系统探讨了呋虫胺对甲壳动物凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）生理生化、肠道菌群和代谢物的浓度依赖效应，并进一步揭示了呋虫胺、肠道菌群和代谢物之间的相互作用。研究结果表明，呋虫胺会引起对虾的氧化应激，导致其生长性能下降、生存率降低。其次，在呋虫胺的胁迫下，对虾肠道中条件致病菌的相对丰度升高，打破了肠道菌群互作网络的稳定状态，造成菌群功能的紊乱。同时，呋虫胺浓度的提高显著干扰了关键代谢物的水平，揭示了其对对虾的毒性过程。通过加权相关网络分析（WGCNA）揭示了代谢物与肠道菌群之间的相关性，阐明了对虾对呋虫胺暴露的生物反应机制。最后，研究表明，呋虫胺对对虾具有显著的生物效应，包括生理应激、代谢干扰和肠道菌群变化，这些变化对虾的健康和生存具有潜在的负面影响。这些发现强调了对水环境中使用新烟碱类农药的监管和进一步研究的必要性，以确保水生生态系统的安全和健康。
引言
新烟碱类杀虫剂已成为全球应用最广泛的一类化学品，尤其在农业生产中，其通过高效控制各种害虫的能力使得其市场需求持续增长。然而，这些杀虫剂的广泛使用引起了对环境污染和非靶标生物影响的广泛关注。呋虫胺，作为第三代新烟碱类杀虫剂，在全球范围内广泛应用于多种作物害虫的防控中。虽然其对目标害虫具有优异的控制效果，但其高水溶性特点使其在水环境中的迁移和积累引起了环保专家的担忧。特别是对于水生生态系统中的非靶标生物，呋虫胺可能构成严重风险。
研究显示，呋虫胺对蜜蜂等重要的生态系统服务提供者有致命影响，可能导致种群的显著下降或功能受损。此外，对于水生环境中的甲壳类动物，如凡纳滨对虾，由于其生命周期中某些阶段极易受到水中溶解性污染物的影响，因此呋虫胺的存在可能对其生存和健康造成严重威胁。尽管已有研究聚焦于呋虫胺对一些非靶标生物的急性影响，但关于其慢性影响的研究仍然不足。特别是对于甲壳类动物这样的敏感生物，长期接触低剂量呋虫胺的生态和生物化学影响尚未得到充分理解。
因此，本研究旨在填补这一研究空白，通过系统性研究呋虫胺对凡纳滨对虾的慢性毒性效应。通过评估呋虫胺对对虾的生长性能、生物化学响应、肠道微生物群以及代谢物的影响，本研究深入探索了其潜在的毒理机制。研究结果不仅有助于理解新烟碱类杀虫剂对水生甲壳类动物的具体影响，也为制定更合理的环境保护措施提供了科学依据，以平衡这类化合物的农业使用与环境安全之间的关系。
图文导读
图1：慢性暴露下，呋虫胺对凡纳滨对虾生长性能的影响。
研究发现，虽然低浓度（6和60 μg/L）的呋虫胺对对虾的存活率和繁殖能力影响不大，但在600 μg/L的高浓度下，这两项指标均出现了显著下降。值得注意的是，所有处理组的凡纳滨对虾都显示出肝体指数的显著降低，这表明即便是低浓度的呋虫胺也可能引起对虾的生理应激。特别是在600 μg/L的浓度下，凡纳滨对虾的体重增长率不降反升，这一反常现象揭示了凡纳滨对虾可能在高浓度呋虫胺的压力下启动了复杂的生理和代谢调节机制（图1）。
图2：呋虫胺慢性暴露对对虾生化指标的影响。
进一步的，研究发现呋虫胺对凡纳滨对虾造成的氧化应激不仅引起了脂质过氧化的增加，表现为丙二醛（MDA）含量的显著上升，而且还影响了肝胰腺细胞的健康，这从丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性的显著增加中可见。这些损伤可能由于抗氧化系统饱和和污染物积累导致。此外，呋虫胺暴露还触发了对虾的防御机制，导致过氧化氢酶（CAT）活性显著增加，显示出其在抗击由外源物质转化过程中产生的活性氧（ROS）中的关键作用。同时，红霉素N-去甲基酶（ERND）和氨基嘧啶N-去甲基酶（APND）活性的提高表明对虾已启动呋虫胺的解毒过程。然而，虽然谷胱甘肽（GSH）水平上升，谷胱甘肽S-转移酶（GST）的活性却受到抑制，暗示氧化应激可能通过累积的ROS干扰了GST的功能，导致未被利用的GSH过剩（图2）。这些结果揭示了呋虫胺引发的一系列生物化学反应及其对水生生物健康的潜在威胁，强调了对这种农药环境影响的进一步研究的重要性。
图3：呋虫胺对对虾肠道微生物组成的影响。
呋虫胺改变了其肠道微生物的组成，导致微生物群落的结构相似性分离，内部组成重塑。例如，在门的分类水平上，随着呋虫胺浓度的调节，变形菌门的相对丰度显著增加，而拟杆菌门的相对丰度则显著减少。拟杆菌门在许多重要的肠道代谢活动中发挥作用，例如碳水化合物的发酵、含氮物质的利用，以及胆酸和其他类固醇的生物转化，并且在防止可能殖民和感染肠道的潜在病原体中扮演重要角色。相反，变形菌门包含了多种病原体，如弧菌。因此，由于呋虫胺导致的拟杆菌门相对丰度的减少，对虾可能降低了其代谢能源的能力，并且由于变形菌门相对丰度的增加，可能接触到更多病原体，使得微生物生态变得更加脆弱。特别是，作为机会性病原体的弧菌，在呋虫胺浓度增加时相对丰度逐渐增加，表明即使低浓度的呋虫胺暴露也可能诱发弧菌的繁殖，从而增加对虾疾病的风险。然而，令人惊讶的是，在最高浓度下，弧菌的相对丰度显著减少，被另一种条件性病原菌Photobacterium取代（图3）。
图4：呋虫胺暴露下肠道微生物群属水平的相互作用网络。
此外，肠道微生物可以通过微生物群体间复杂的生态网络维持肠道稳态，而本研究发现呋虫胺破坏了凡纳滨对虾肠道微生物群落的平衡，表现为微生物间相互作用的显著减少。当达到特定浓度的呋虫胺时，微生物群落间的显著正相关性增加，通常表明维持肠道稳态的不利状态。肠道微生物群落间竞争比例的减少可能使对虾更容易受到疾病风险的威胁（图4）。
图5：呋虫胺暴露后对虾肠道菌群的BugBase表型预测。
本研究发现，暴露于呋虫胺的凡纳滨对虾的肠道微生物群受到明显影响，还表现为各项表型的显著差异（图5）。呋虫胺浓度增加导致微生物群结构相似性发生变化，且部分潜在致病菌丰度明显上升。值得关注的是，抗氧化应激反应显著增加，而生物膜形成能力明显下调。此外，呋虫胺暴露后，肠道微生物群中的移动元件表型显著上调，表明微生物群可能通过演化抵御呋虫胺的负面影响。这些发现表明，呋虫胺可能导致凡纳滨对虾微生物群失衡，增加了宿主受到病原菌侵袭的风险，同时也可能降低了其对环境刺激的适应能力。
进一步的，本研究通过代谢组学探索了呋虫胺对凡纳滨对虾代谢的影响。结果显示，呋虫胺对对虾代谢产生了剂量依赖性的影响。随着水中杀虫剂浓度的增加，显著差异的代谢产物和富集途径数量明显上升，这一模式与其他环境污染物的响应相一致，表明呋虫胺可能通过破坏对虾的代谢过程而诱发身体损伤和死亡。脂质代谢在为生物提供必需脂肪酸和能量方面起着关键作用，并在水生动物对环境压力的免疫应答中发挥着重要作用。在暴露于不同浓度的呋虫胺下，与脂质代谢相关的代谢产物占据了不同代谢物的大部分比例，这表明脂质相关的代谢产物在环境压力下有很强的响应。此外，呋虫胺可能干扰对虾的氨基酸代谢，这可能导致整体代谢系统失衡。高浓度的呋虫胺可能导致对虾脂肪积累增加，同时引起神经毒性，可能是对虾大规模死亡的原因之一。感兴趣的是，所有浓度下都观察到了神经元相关通路的显著富集，暗示了呋虫胺可能对对虾的生物钟功能造成影响。总之，呋虫胺暴露引起的氧化应激可能是导致对虾死亡和细胞受损的重要机制之一。
图6：由WGCNA确定的虾暴露于呋虫胺的代谢物网络和关键候选代谢物。
在本研究中，我们通过WGCNA发现Crustecdysone在代谢物相关网络中具有很高的连接度（图6）。Crustecdysone是一种在螃蟹、龙虾和虾等甲壳动物中起关键作用的激素，它调节着这些生物的脱壳过程，这是它们生长的关键步骤。因此，我们推测在呋虫胺的暴露下，凡纳滨对虾体内Crustecdysone含量的增加可能会诱导脱壳现象的发生。这一过程导致了更高的死亡率。此外，通过ROC分析，我们筛选出与呋虫胺浓度相关的关键代谢物，其中N-乙酰半胱氨酸表现出了稳定和可靠的特性。尽管我们对这种代谢物在生物体内的作用尚不清楚，但我们认为未来通过进一步的靶向代谢组学研究对于了解水生物种的生理反应至关重要。这些发现对于我们更全面地评估农药对水生态系统的影响以及保护水生物种的生存具有重要意义。
图7：WGCNA鉴定的代谢物和肠道微生物群的相互作用分析。
值得一提的是，在虾类中，肝胰腺也是一个至关重要的消化器官，负责消化和新陈代谢。它产生的代谢物可能通过排泄或分泌进入肠道，影响肠道微生物群的组成和活动。这些代谢物可能影响微生物群的多样性和代谢活性。本研究发现，暴露于呋虫胺后，Caldine的丰度表现出先减少后增加的趋势。这些代谢物可能对蛋白质、DNA和其他细胞组分造成毒性损害，或诱导氧化应激。因此，肠道微生物群的抗氧化应激表型显著升高，可能与Caldine代谢的显著变化有关。此外，先前的研究表明，Indican影响肠道微生物群的结构。在本研究中，Caldine和Indican与肠道微生物群的两个主要OTU模块呈显著负相关。因此，呋虫胺引起的Caldine和Indican相对丰度的显著变化可能导致凡纳滨对虾肠道微生物群结构的重塑。
小结
这项研究全面分析了凡纳滨对虾长期暴露于呋虫胺后的影响，包括表型变化、与生长相关的生化标志物以及氧化应激标志物的变化。通过研究肠道微生物群的结构和功能，我们发现呋虫胺对某些关键微生物群有不良影响。通过非靶向LC-MS/MS代谢组学分析，我们确定了关键的代谢标志物，并解释了暴露于不同呋虫胺浓度下的对虾代谢反应。这项研究为探究甲壳类动物在分子水平上如何应对呋虫胺暴露提供了首个参考数据集。此外，它促进了在甲壳类动物中发现关键代谢物和生物标志物的发现。尽管取得了重大进展，但仍存在挑战和知识空白需要进一步研究。未来的研究应重点探讨不同手性农药对甲壳类动物的影响，以填补当前的知识空白，并建立生态友好型农药开发的框架。
作者简介
通讯作者：韩凤禄 ，博士，海南大学硕士生导师，海南省其他类高层次人才，研究方向为虾蟹类环境生理与健康调控。作为主持人承担海南省重点研发项目、青年自然科学基金、农业农村部重点实验室开放课题重点项目、江苏省水产动物营养重点实验室开放课题等项目9项，先后参与国家重点研发项目和国家自然科学基金及省级重点研发等课题7项。近五年发表学术论文40余篇，以第一作者或通讯作者身份发表SCI收录论文20篇，ESI高被引论文1篇；授权国家发明专利1项；获上海市水产学会优秀论文二等奖2项。
通讯作者：李二超 华东师范大学教授、博士生导师。中法联合培养硕士和博士、美国农业部博士后、海南省领军人才、中国动物学会/中国海洋湖沼学会甲壳动物学会理事、海南省原良种审定委员会委员、《Aquaculture, Fish and Fisheries》副主编、《Aquaculture Nutrition》学术编辑、《Aquaculture》及《热带生物学报》等杂志编委。曾赴法国、墨西哥、美国等多所科研单位进行学习和合作研究。一直致力于水产动物环境生理与营养调控研究，先后主持、承担国家自然科学基金、国家重点基础研究发展计划（973计划）、公益性行业（农业）科研专项及省级自然科学基金等国家和省部级课题30余项目，发表学术论文250余篇(SCI收录200余篇)，其中ESI高被引4篇，专著3部，参与获得省部级等科技进步将等3项。
JHM家族期刊包括Journal of Hazardous Materials (JHM)，Journal of Hazardous Materials Letters (JHM Letters), 和Journal of Hazardous Materials Advances (JHMA)。三本期刊拥有相同的scope，侧重在环境危险物质的迁移，影响，检测，和去除。旗舰期刊JHM发表高水平科研和综述文章，JHM Letters完全开放获取，发表Letter-type科研和前沿综述文章（3000字限制，4副图/表），JHMA定位为中档开放获取期刊。
