第一作者：王绪迪
通讯作者：李力
通讯单位：山东大学环境科学与工程学院
论文DOI：10.1016/j.jhazmat.2024.134310
图片摘要
成果简介
近日，山东大学李力教授在Journal of Hazardous Materials上发表了题为“Metabolic cross-feeding between the competent degrader Rhodococcus sp. strain p52 and an incompetent partner during catabolism of dibenzofuran: Understanding the leading and supporting roles”的研究论文。本研究阐明了高效降解二苯并呋喃的红球菌p52与不能利用二苯并呋喃的菌株在协同降解二苯并呋喃过程中的代谢互养协作机制，拓展了我们对难降解污染物降解过程中细菌代谢互养协作的认识。深入理解微生物之间的代谢互养协作可为选择生物强化菌或设计合成微生物群落提供依据，有助于污染环境生物修复的成功实施。
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二苯并呋喃作为一类难降解有机污染物而广受关注。红球菌p52可以有效利用一系列有机污染物支持生长，包括二苯并呋喃、2-氯二苯并呋喃、2,8-二氯二苯并呋喃、二苯并-对-二噁英等，显示出良好的应用潜力。然而菌株p52与污染基质中土著细菌间的代谢相互作用模式尚不清楚，因此本研究采用人工构建菌群结合共培养技术，研究二苯并呋喃降解过程中细菌间的代谢互养协作。分别将二苯并呋喃高效降解菌—红球菌p52与不能利用二苯并呋喃的两株土壤分离菌株—节杆菌（Arthrobacter sp.）菌株W06和无色杆菌（Achromobacter sp.）菌株D10共培养，考察菌株W06与D10对菌株p52生长及二苯并呋喃降解的影响；在降解过程中分析二苯并呋喃代谢的关键中间产物，检测其在红球菌胞内、胞外的浓度及其生物毒性，探讨其对菌株p52降解二苯并呋喃的影响，并通过RT-qPCR技术检测各菌株中与二苯并呋喃及其中间产物代谢相关的基因表达水平。研究结果表明，菌株p52在共培养体系中生长及二苯并呋喃降解优于其单独培养，且菌株W06或D10在与p52共培养时可生长而单独培养时则不能。研究发现，菌株p52降解二苯并呋喃过程中产生的中间代谢产物如水杨酸和龙胆酸一部分释放到细胞外，可被菌株W06或D10利用支持生长；而这两种中间代谢产物均有生物毒性，可抑制菌株p52对二苯并呋喃的降解。研究表明，由于菌株W06和D10可分别代谢水杨酸和龙胆酸，降低了共培养体系中代谢中间产物的生物毒性，从而促进菌株p52生长及二苯并呋喃降解。菌株W06及D10通过不同作用机制促进了菌株p52降解二苯并呋喃，同时菌株p52也促进了菌株W06及D10对水杨酸和龙胆酸的代谢。本研究阐明了红球菌p52与菌株W06及D10通过代谢互养协作去除二苯并呋喃的机制，该过程涉及菌株p52在二苯并呋喃代谢途径中的主导作用，以及代谢水杨酸和龙胆酸的协作菌株的辅助作用。本研究为微生物代谢互养协作在难降解有机物污染环境的生物修复中的作用提供了新的认识视角。
引言
二苯并呋喃是一种多环芳烃，也是二噁英的非卤化母体，在环境中广泛存在；作为一类难降解有机污染物，因其对人体及环境健康的危害而受到持续关注。环境中的土著微生物往往缺乏能够代谢二苯并呋喃等难降解有机污染物的关键酶，因此生物强化是生物修复其污染环境的优选策略。然而在生物强化修复过程中，生物强化菌和土著细菌之间的代谢相互作用在较大程度上并不清楚，这种认知空白限制了有降解能力的细菌作为生物强化菌应用于生物修复。
图文导读
共培养有利于各菌株生长及二苯并呋喃降解
将与节杆菌W06和无色杆菌D10共培养的红球菌p52与其单独培养相比较，考察48 h内二苯并呋喃的降解效果，结果表明共培养24 h之后对二苯并呋喃的去除率高于菌株p52单独培养时（图1a）；同时，在共培养24 h后菌株p52的细胞密度高于其单独培养，且在36 h后前者的密度是后者的2倍以上（图1b）。这说明菌株W06和D10的存在促进了二苯并呋喃的降解和菌株p52的生长。另一方面，菌株W06和D10单独培养时不能利用二苯并呋喃作为碳源支持生长，但分别与菌株p52共培养24 h后其细胞密度显著增加（图1c），说明菌株p52降解二苯并呋喃过程中产生并向胞外释放了支持菌株W06和D10生长的碳源。
图1：（a）单培养和共培养体系中二苯并呋喃的降解效果；（b）单培养和共培养体系中红球菌p52的生长状况；（c）单培养和共培养体系中节杆菌W06和无色杆菌D10的生长状况。
共培养的菌株可以利用红球菌p52产生的胞外代谢产物支持生长
在红球菌p52降解二苯并呋喃过程中收集培养液，以0.22 m滤膜过滤除去p52制备无细胞滤液，用于培养节杆菌W06和无色杆菌D10，检测菌株W06和D10在其中的生长状况。结果表明，菌株W06和D10均能利用菌株p52在降解二苯并呋喃过程中的胞外代谢产物（图2a和2b）。此外，菌株W06的生物量略高于菌株D10，说明两株菌利用p52降解二苯并呋喃过程中产生的代谢产物的能力不同。在除去了多糖和蛋白质的无细胞滤液中培养菌株W06和D10，发现W06和D10均可利用不含多糖和蛋白质的p52的胞外代谢产物生长，并且其生长与在未除去多糖和蛋白质的滤液中的生长相当（图2c和2d）。而以p52降解二苯并呋喃过程中分泌的胞外多糖和蛋白质作为无机盐培养基中的唯一碳源时，菌株W06和D10的生长可以忽略不计。这些结果表明，菌株p52降解二苯并呋喃过程中释放的代谢中间产物，但不是胞外多糖和蛋白质，可以支持菌株W06和D10生长。
图2：（a）收集红球菌p52降解二苯并呋喃18 h、36 h和48 h后的培养液过滤除去细胞，节杆菌W06在滤液中的生长状况；（b）无色杆菌D10在制备的无细胞滤液中的生长状况；（c）&（d）菌株W06和D10在除去多糖和蛋白质的无细胞滤液（收集于48 h）、未经处理的无细胞滤液（含多糖和蛋白质）和添加了p52胞外分泌的多糖和蛋白质的无机盐培养基中的生长状况。
共培养的菌株可利用水杨酸或龙胆酸支持生长
水杨酸和龙胆酸是二苯并呋喃降解途径中的关键代谢中间产物，通过GC-MS分析表明，红球菌p52在二苯并呋喃降解过程中产生的水杨酸和龙胆酸可释放到胞外。因此进一步测定了菌株W06和D10对水杨酸和龙胆酸的利用能力。菌株W06不能利用龙胆酸，但能在72 h内降解97.2%的180 mg/L水杨酸，而菌株D10不能利用水杨酸，但能在48 h内降解98.3%的180 mg/L水杨酸；并且这两种化合物均可以作为碳源支持菌株生长（图3a和3b）。此外，分析红球菌p52降解二苯并呋喃过程中胞内和胞外水杨酸、龙胆酸的含量，结果表明，在二苯并呋喃的降解过程中，水杨酸和龙胆酸的外排量相对较高，12 h后在胞外的浓度高于胞内的浓度；且随着时间的推移产生积累，48 h后水杨酸和龙胆酸的胞外浓度分别达到胞内浓度的1.7倍和3.0倍（图3c）。这些结果说明菌株W06和D10可以利用菌株p52降解二苯并呋喃过程中外排的水杨酸或龙胆酸支持生长，从而促进二苯并呋喃降解。
图3：（a）节杆菌W06对二苯并呋喃代谢中间产物—水杨酸的利用及其生长状况；（b）无色杆菌D10对二苯并呋喃代谢中间产物—龙胆酸的利用及其生长状况；（c）二苯并呋喃降解中间产物在红球菌p52胞内和胞外的浓度。
水杨酸和龙胆酸具有生物毒性，二者积累可抑制二苯并呋喃降解
研究水杨酸和龙胆酸对红球菌p52降解二苯并呋喃的影响，发现无论在二苯并呋喃降解过程中的0 h还是18 h外加水杨酸和龙胆酸，二苯并呋喃的降解速率都有所下降，且在18 h添加二者的不利影响更大（图4a和4b）。这些结果表明，这两种中间代谢产物可抑制红球菌p52对二苯并呋喃的降解，降解中期的添加会加剧中间代谢产物的积累，对二苯并呋喃降解的抑制作用更大。通过分析菌株p52胞内ROS相对水平和青海弧菌Q67的发光强度变化，发现水杨酸和龙胆酸的生物毒性随着浓度增加而增加，且水杨酸的毒性大于龙胆酸（图4c）。此外，在二苯并呋喃降解后期（48 h），由于代谢中间产物的浓度相对较高，所产生的生物毒性相对较强（图4d）。另一方面，菌株p52与W06共培养降解二苯并呋喃时胞外代谢产物的毒性低于与菌株D10共培养，这与菌株W06可利用毒性相对更强的水杨酸有关。以上结果表明，菌株W06和D10可利用积累的具有生物毒性的二苯并呋喃代谢中间产物，从而缓解了代谢产物对二苯并呋喃降解的抑制，促进二苯并呋喃的降解。
图4：（a）二苯并呋喃降解0 h、18 h添加180 mg/L水杨酸对二苯并呋喃降解的抑制作用；（b）二苯并呋喃降解0 h、18 h添加180 mg/L龙胆酸对二苯并呋喃降解的抑制作用；（c）5 mg/L、10 mg/L和20 mg/L代谢中间产物造成红球菌p52胞内ROS相对水平的变化（散点图），以及对青海弧菌（Vibrio qinghaiensis）Q67发光强度的抑制作用（柱状图）；（d）二苯并呋喃降解24 h、48 h，单独培养的菌株p52、与节杆菌W06或无色杆菌D10共培养的菌株p52胞外代谢产物对胞内ROS相对水平（散点图）及青海弧菌Q67发光强度的影响（柱状图）。
共培养时各菌株中与二苯并呋喃降解途径相关的基因在转录水平受到调控
根据基因组测序和基因注释结果，通过BLAST和保守结构域分析，预测出菌株W06和D10中与水杨酸和龙胆酸代谢相关的基因。此外，通过UPLC-MS/MS检测了菌株W06代谢水杨酸和菌株D10代谢龙胆酸的产物。在此基础上结合文献报道，分别推导出两种化合物在菌株W06和D10中的代谢途径，并与红球菌p52进行了比较。菌株W06的代谢水杨酸途径涉及辅酶a衍生物。首先，sdgA编码的水杨酸-辅酶A 5-羟化酶催化水杨酸经水杨酸-腺苷酸转化为水杨酸-辅酶A，然后sdgC编码的水杨酸-辅酶A合成酶将水杨酸-辅酶A羟基化生成龙胆酸-辅酶A（图5d）。该代谢途径与菌株p52中发生的过程不同，后者水杨酸通过水杨酸5-羟化酶直接转化为龙胆酸。菌株D10与p52的龙胆酸的代谢途径相同，均由龙胆酸1,2-双加氧酶催化龙胆酸开环形成马来酰丙酮酸（图5e）。此外，在共培养的菌株中检测了与二苯并呋喃、水杨酸和龙胆酸代谢的相关基因的相对表达水平。菌株p52携带两个不同的基因簇（dfdA和dbfA）参与了二苯并呋喃的初始双羟化。当菌株p52与W06或D10共培养时，这些基因的表达量均发生不同程度的上调，表明菌株p52在共培养过程中对二苯并呋喃的降解能力增强。当菌株p52与W06共培养时，水杨酸降解相关基因nagH1和nagH2的表达量上调；相反，参与龙胆酸降解和运输的基因（genD和genK）的表达水平下调（图5f）。当菌株p52与D10共培养时，参与水杨酸和龙胆酸降解的基因（nagH1、nagH2和genD）表达量上调，而参与龙胆酸转运的基因genK表达量下调（图5g）。菌株W06和D10与p52共培养时，W06中水杨酸代谢基因和D10中龙胆酸降解基因的表达水平上调（图5h）。因此，菌株W06和D10可分别通过代谢水杨酸和龙胆酸协助菌株p52进行中间产物转化，从而减轻中间代谢产物对二苯并呋喃降解的抑制作用。另一方面，菌株p52的存在也促进了菌株W06和D10对水杨酸和龙胆酸的代谢能力。
图5：（a）UPLC-MS/MS分析的总离子流色谱图显示节杆菌W06降解水杨酸的代谢产物峰；（b）UPLC-MS/MS分析的总离子流色谱图显示无色杆菌D10降解龙胆酸的代谢产物峰；（c）红球菌p52降解二苯并呋喃的途径（显示重要中间产物水杨酸和龙胆酸）；（d）菌株W06代谢水杨酸的途径；（e）菌株D10代谢龙胆酸的途径；（f）以相同条件下单独培养的菌株p52作为对照，与W06在添加二苯并呋喃的无机盐培养基中共培养时，菌株p52代谢相关基因的相对表达量；（g）以相同条件下单独培养的菌株p52作为对照，与D10在添加二苯并呋喃的无机盐培养基中共培养时，菌株p52代谢相关基因的相对表达量；（h）分别以单独培养的菌株W06、D10为对照，与菌株p52在添加水杨酸或龙胆酸的无机盐培养基中共培养时，菌株W06及D10代谢相关基因的相对表达量。
小结
将高效降解二苯并呋喃的红球菌p52与不能降解二苯并呋喃的节杆菌W06和无色杆菌D10分别共培养，可促进了菌株p52的生长和对二苯并呋喃的降解。菌株p52降解二苯并呋喃过程中向胞外释放降解中间产物—水杨酸和龙胆酸，二者可分别作为菌株W06和D10生长的碳源。水杨酸和龙胆酸具有生物毒性，二者积累可抑制二苯并呋喃的降解。因此，菌株W06和D10对降解中间产物的代谢减轻了其毒性和对二苯并呋喃降解的抑制作用。基于二苯并呋喃降解中间产物，菌株p52与共培养的菌株之间可建立代谢互养协作关系。在协作的菌株中，参与二苯并呋喃及其降解中间产物代谢的基因在转录水平上一致调控，从而协同降解二苯并呋喃。本研究拓展了对难降解有机污染物降解过程中细菌间代谢互养协作的认识。
作者简介
第一作者：王绪迪，环境科学与工程专业在读硕士研究生，主要研究方向为二噁英的微生物降解及细菌间相互作用。以第一作者在J Hazard Mater发表论文1篇，在J Cleaner Prod参与发表论文1篇。
邮箱：wangxudi1999@163.com。
通讯作者：李力教授，博士生导师，主要从事环境微生物学与技术、生物修复、环境生态学领域的相关研究，近年来围绕难降解有机污染物的微生物降解、降解质粒接合转移、生物强化与生物修复等开展研究，作为通讯作者在Environ Sci Technol、J Hazard Mater、J Cleaner Prod等国际重要期刊撰文报道了关于红球菌（Rhodococcus sp.）菌株p52的一系列研究进展。先后主持国家自然科学基金项目4项、国家重大科技专项—水体污染控制与治理重大专项子课题（分任务）4项，授权国家发明专利7项。
邮箱：lili@sdu.edu.cn。
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