第一作者：江志通
通讯作者：李周坤、董维亮、李延伟
通讯单位：南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物学重点实验室、江苏省南京农业大学固体有机废物利用重点实验室、南京工业大学生物技术与制药工程学院废塑料生物催化降解与资源化重点实验室、山东大学环境研究所
论文DOI：10.1016/j.jhazmat.2024.134493
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成果简介
近日，南京农业大学崔中利教授团队联合南京工业大学董维亮教授团队，以及山东大学环境研究所李延伟教授共同在Journal of Hazardous Materials上发表题为“Novel polyurethane-degrading cutinase BaCut1 from Blastobotrys sp. G-9 with potential role in plastic bio-recycling”的研究论文。本研究首先对垃圾填埋场中PU塑料的降解进行了初步观察，并通过扫描电镜（SEM）和结构表征证实了PU塑料发生了生物降解。通过建立一种以合成的固体聚酯PU（PBA-PU）为标记物的快速筛选方法，筛选出了一株降解效果最好的真菌菌株Blastobotrys sp. G-9。研究结果表明，菌株G-9可以通过一个新发现的角质酶BaCut1，将PUR和PBAT转化为己二酸，为PU和PBAT的工业生物回收利用提供了可能。
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塑料废弃物的处理已经成为全球性的问题，为了实现循环利用的塑料经济，生物降解回收塑料废弃物成为一种吸引人的策略，但需要有效的降解微生物和酶。本研究首先对从20年的垃圾填埋场中采集的PUR类塑料废物进行表征分析，发现生物降解的迹象（步骤1）。接着，从垃圾填埋场中收集的PUR塑料中分离出Blastobotrys sp. G-9，其具有粘附塑料表面和分解聚氨酯（PUR）的能力（步骤2）。最后，从菌株G-9中成功鉴定到角质酶BaCut1，该酶通过特殊的底物结合模式将PUR和PBAT高效降解为己二酸（步骤3）。BaCut1介导的PUR降解为PUR塑料废弃物的生物回收利用带来了替代途径，但如何实现废弃物PUR的闭环回收利用过程还有待进一步探索（步骤4）。
引言
塑料污染已成为全球关注的热点环境问题。与传统的废物处理方法（如机械和化学回收）相比，利用微生物或酶的生物降解和回收技术已成为有前途的策略。近年来，已鉴定出大量的聚酯塑料降解微生物，这些微生物分泌能够降解PU或PBAT的各种水解酶，例如酯酶、角质酶、脂肪酶、酰胺酶、尿素酶和蛋白酶。但是迄今为止发现的大多数微生物和酶在降解PU塑料方面表现出有限的效率，需要进一步挖掘新的PU降解微生物及降解酶，并解析相关酶的催化机制。
图文导读
垃圾填埋场的PU类塑料发生了生物降解
图1：采集自安徽泾县垃圾填埋场的塑料垃圾表面分析。从填埋场2 m深处收集了PU类塑料垃圾，SEM分析显示R2的褶皱和穿孔结构与具有光滑结构表面的R1对比。比例尺：100 µm。
来自于塑料废弃物的菌株Blastobotrys sp. G-9的聚氨酯降解能力评估
为了从塑料废弃物中分离出参与PU降解的微生物，作者在对其表面土壤圈微生物群进行长时间的富集的基础之上，使用Impranil®DLN、合成的PU寡聚物PBA-PU、商业聚酯PU泡沫三种底物层层筛选分离出菌株Blastobotrys sp. G-9。聚酯PU泡沫减重优化实验表明，菌株G-9的PU降解依赖于可用的营养，其无法仅以塑料作为碳源生长。为了评估孵育时间对PU降解的影响，将菌株G-9在含有1% PU泡沫（w/v）的YPD富集培养基中孵育。在培养7天后，PU泡沫废料的重量损失达到41.0%，在孵育21天后增加到68.1%（图2b）。在孵育14天和21天后观察到类似的重量损失，表明酯酶对PU的软链段的可接近性质，而包含异氰酸酯基团和扩链剂部分的硬链段对酶促水解保持高度抗性。此外，SEM观察显示大量酵母细胞粘附在PU泡沫表面，伴有可见的裂纹和穿孔结构，而来自对照组的PU泡沫表现出正常的外观（图2c）。综上所述，菌株G-9是通过酯键的酶解作用来催化聚氨酯泡沫软段的水解。
图2：YPD培养基中Blastobotrys sp. G-9降解聚酯聚氨酯泡沫塑料的研究。营养物质(a)和培养时间(b)对菌株G-9降解的PU泡沫塑料(PUR)失重和完整性的影响；c：菌株G-9处理第21天后PUR泡沫表面的扫描电子显微镜分析。比例尺：20 µm。
来自菌株G-9的聚氨酯降解角质酶的分离纯化及鉴定
为了评价菌株G-9胞外上清液的聚氨酯降解活性，将一块PU泡沫（50 mg）接种在100 mL抗菌剂溶液中，在30 ℃下孵育2天，SEM观察结果显示，在SUP处理的样品中存在大量降解和塌陷的骨架结构，存在裂纹和穿孔结构（图3a），与在菌株G-9中呈现相似的效果。作者利用酯酶活性作为指示剂来指导蛋白质纯化过程，对其SUP进行浓缩纯化，酶谱分析了纯化的蛋白具有酯酶活性（129.5 U/mg）和PBA-PU降解能力（图3b）。为了进一步验证纯化蛋白的PU降解能力，作者评价了纯化的酶对PBA-PU和聚酯PU泡沫的降解能力。纯化的酶可将可乳化的PBA-PU溶液分解成澄清状态（图3c），并且PU泡沫的降解具有时间和剂量依赖性，产生己二酸介导的酸化环境（图3d，e）。这些结果表明，纯化的具有酯酶活性的酶可以降解商品PU。结合蛋白质鉴定和菌株G-9基因组分析确定该蛋白的编码基因为GME5380，编码蛋白命名为BaCut1。
图3：SUP和纯化的PU解聚酶降解PBA-PU和PU泡沫。a：PU泡沫（PUR）的表面在SUP处理后的SEM分析，比例尺：左（低倍放大），150 µm;右侧（高放大倍数），10 µm；b：纯化的PU解聚酶的SDS-PAGE和酶谱分析，泳道M，分子量标记物；泳道1，纯化的酯酶;泳道2，由pNPB孵育显示的黄色条带；泳道3，由PBA-PU的酶促水解引起的透明条带，其由红色箭头指示；c，通过纯化的PU-解聚酶对PBA-PU溶液的降解评价，0、30和90指示不同的反应时间，+指示酶添加; -指示对照；反应时间（d）和酶用量（e）对PU泡沫降解效率（重量损失和pH值）的影响。
BaCut1通过断裂酯键解聚PU泡沫和PBAT
为了评估BaCut1在塑料解聚和资源化中的潜在应用，在最佳条件下，对聚氨酯泡沫塑料和PBAT农膜进行了降解实验。BaCut1对PU和PBAT均表现出剂量依赖性降解。BaCut1能在48h内降解50%的聚酯PU泡沫（图4a），导致PU泡沫的骨架结构显著降解和塌陷，产生大量孔洞和裂缝（图4 b）。GPC分析显示，聚酯PU泡沫的Mn和Mw分别降低41.9%和10.7%（图4c-d）。质谱分析确定其降解产物为己二酸（图4 e），对应于G-9介导的PU泡沫降解。这些结果表明，来自Blastobotrys sp. G-9的BaCut1通过酯键断裂来解聚PU。
图4：BaCut1对聚酯PU泡沫的降解能力。a：在不同酶用量下，在37 ℃下BaCut1催化聚氨酯泡沫（PUR）水解48 h，CK1表示未进行任何处理的PU泡沫，CK2表示具有酸灭活的BaCut 1的PUR泡沫；b：BaCut1处理后PUR泡沫表面的SEM分析，比例尺：左（低放大倍数），50 μm；右（高放大倍数），5 μm；固体样品CK1和0.5 mg BaCut1处理的PUR的分子量分布（c）和分子量直方图（d）；e：BaCut 1介导的PUR水解产物鉴定。
为了分析BaCut1在降解农用塑料薄膜中的潜力，作者对暴露于0.5mg BaCut1的商业PBAT薄膜进行降解测试。BaCut1能在48h内降解18%的PBAT薄膜（图5a）。此外，通过LC-MS检测到五种主要中间体，表明BaCut1能通过催化酯键完全解聚PBAT。SEM观察显示未处理的PBAT膜中的清洁表面和不存在断裂，而经处理的膜在BaCut1处理后表现出穿孔结构和粗糙表面（图5c）。这些结果表明BaCut1也能够将PBAT膜降解成它们的单体成分。鉴于BaCut1在环境温度下的高活性，BaCut1可用于聚酯塑料的酶促加工，有助于循环塑料经济的潜力。因此，使用HPLC和商业己二酸介导的标准曲线定量测定来自BaCut1介导的PU和PBAT解聚的己二酸单体。在37 ℃下使用8%的酶剂量持续24小时，从PU降解溶液中回收己二酸，产率为43.9%，而从PBAT降解溶液中回收己二酸的分离产率为33.2%（表1）。这些结果表明BaCut1具有生物降解PU和PBAT的潜力，为从商业聚酯产品中回收单体提供了一种有前途的途径。
图5：BaCut1对PBAT膜的降解能力。在不同酶用量下，在37 ℃下BaCut1催化PBAT膜水解48 h，CK1表示未进行任何处理的PBAT膜，CK2表示具有酸灭活的BaCut1的PBAT薄膜；b：基于质谱鉴定了BaCut1介导的PBAT膜水解的中间体的结构；c：在BaCut1处理后PBAT膜表面的SEM分析，比例尺：左（低放大倍数），100 μm；右（高放大倍数），10 μm。
表1：用BaCut1水解PU和PBAT得到的己二酸定量。
BaCut1与LCC、PETase解聚聚酯塑料能力的比较
考虑到角质酶对PU泡沫和PBAT的有效解聚，比较了LCCICCG（F243 I/D238 C/S283 C/Y127 G）、IsPETase和BaCut 1在不同温度下使用市售PU泡沫和PBAT膜水解PU泡沫和PBAT的活性。在PU泡沫解聚过程中，BaCut1在37和45 ℃下的表现优于LCCICCG，在37 ℃的最佳催化温度下，BaCut1在PBAT降解方面优于LCCICCG（图6 b）。当与IsPETase相比时，BaCut1在最佳催化温度下的PU解聚性能表现优于IsPETase（图6c）。然而，IsPETase在PBAT降解方面表现出比BaCut1更好的性能。值得注意的是，与LCC具有高PET特异性解聚速率不同，BaCut1对PET没有活性。
图6：LCCICCG、BaCut1和IsPETase对PU泡沫和PBAT的特异性解聚性能比较。
BaCut1介导的聚合单体积累的可能催化机制
与其他酯酶相比，角质酶BaCut1表现出不同的水解模式。因此，通过结构模拟和分子对接进一步阐明了BaCut1介导的PU分解催化机理。保守氨基酸S107、D184、H199被确定为催化三联体，PBA-PU模型底物紧密地配合在BaCut1的活性位点内（图7a）。催化三联体接近脂肪链部分（图7a），其延伸以适合于由氨基酸如E41、T47、Y106、I195和L200排列的裂缝内。BaCut1活性位点的其它残基（如Q76、L161、S162和I195）主要参与PBA-PU的芳香部分相互作用。为了验证特定氨基酸的作用，构建了相应的定点突变体。D184A、G38A、E41A、Y106A和T47A表现出酯酶活性的显著降低，其次是I195A和L200A（图7 b）。结合生物化学和结构分析，作者提出了BaCut1在PU结合和生物降解中的潜在机制。PBA-PU模型底物的结合构象表明，S107可能攻击邻近己二酸末端的酯键，生成己二酸、AB和1，4-丁二醇等产物。BaCut1通过将脂族链定位在疏水底物结合口袋（G38、E41、Y106、I195、L200）内来识别PBA-PU。由于G38A和Y106A变体对PBA-PU的降解能力几乎完全丧失，G38和Y106在BaCut1催化过程中起到充当氧阴离子空穴的作用（图7 c）。
图7：BaCut1催化介导的PU泡沫降解。a：PBA的聚合物链在BaCut1的活性位点隧道中的预测结合模式。提出的催化三元组（S107-H199-D184）和氧阴离子空穴（G38-Y106）分别被着色为红色和蓝色。右边是放大图，PBA与BaCut1中周围残基的相互作用网络以紫红色棒显示。催化三联体残基以绿色棒显示；各种突变体的酯酶活性（b）和PBA降解活性（c）。
小结
本研究在获得良好的实验材料的基础之上，从菌株Blastobotrys sp. G-9中分离到一种新的角质酶BaCut1，该酶具有降解PU和PBAT的能力。BaCut1在37 ℃下降解聚氨酯泡沫塑料48 h，降解率分别为50%和18%。在水解过程中，己二酸作为主要的终产物并通过特殊的PBA链结合特征释放。然而，要实现塑料废弃物的开环回收和升级循环，还需要进一步提高BaCut1解聚酶的催化效率。本研究为聚酯塑料废弃物的上游解聚提供了一个新的微生物及酶资源，BaCut1介导的聚酯塑料降解提供了一种可能的通过生物回收来管理PU塑料废物的替代方法。
本研究得到了国家重点研究发展计划、国家自然科学基金、中央高校基础研究基金和山东省泰山学者计划的资助。
作者简介
第一作者：江志通，南京农业大学生命科学学院，在读硕士，研究方向为塑料废弃物的生物解聚及相关机制解析，以第一作者在Journal of Hazardous Materials、生物工程学报、生物加工过程发表论文3篇。
联系方式：2021116043@stu.njau.edu.cn
通讯作者：李周坤，南京农业大学生命科学学院博士，副教授，硕士研究生导师，生科院微生物学系教师，担任Foods与Frontiers in Microbiology等期刊Guest Editor。主要从事黏细菌资源开发与利用相关研究，基于黏细菌种质资源评价，聚焦黏细菌与土壤微生物互作及黏细菌糖酶生物学功能等基础研究，探索黏细菌在植物病害控制、复杂生物质与废弃物生物转化中的应用性。主持国家自然科学基金、南京农业大学-新疆农业大学联合基金项目等多项课题，是国家重点研发计划绿色生物制造专项的子课题负责人。相关研究成果发表在ISME J、Nature Communications、Microbiome、Appl Environ Microbiol、Food Chem 等期刊上。
联系方式：zkl@njau.edu.cn
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