三阴性乳腺癌免疫微环境与免疫治疗的研究进展

根据世界卫生组织国际癌症研究机构的既往调查数据显示，乳腺癌已取代肺癌，成为全球发病率最高的恶性肿瘤[1]。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一种以雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）阴性为特征的乳腺癌亚型，占乳腺癌的10%～20%[2]。由于TNBC的“三阴”表型特性，使其对内分泌治疗和靶向治疗不敏感，对化疗的反应亦欠佳。近年来，免疫治疗已成为难治性实体瘤的新型治疗选择，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）的成功应用为TNBC的治疗策略带来了新思路。ICIs包括程序性死亡受体-1（programmed death receptor-1，PD-1）、程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）抑制剂等。

相比其他亚型乳腺癌，TNBC具有更高密度的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs），为应用ICIs建立了有利的免疫微环境[3]。此外，TNBC表现出相对较高的肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB），为免疫细胞识别肿瘤提供了抗原基础。同时，TNBC中PD-L1的表达水平高于其他亚型乳腺癌，为使用ICIs提供了重要的靶点[4]。上述特点均为ICIs在TNBC中的应用提供了理论支持。既往临床研究显示，对于PD-L1阳性的TNBC患者，与单纯化疗相比，阿替利珠单抗联合白蛋白结合型紫杉醇治疗可将患者的中位总生存期延长近10个月（NCT02425891）。

本文通过回顾性分析TNBC的免疫微环境、ICIs单药治疗以及ICIs联合其他治疗方案的应用现状，旨在明确有效的免疫治疗策略，为提高TNBC的治疗效果提供依据。

肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）包括肿瘤细胞、癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）、TILs、树突状细胞、中性粒细胞、肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）、自然杀伤（natural killer, NK）细胞、脉管系统、脂肪细胞等，以及生长因子、细胞因子和趋化因子等可溶性因子。TNBC的TME中存在大量免疫细胞、基质细胞和细胞因子，这些因素潜在影响肿瘤细胞对免疫治疗的反应。根据免疫反应的不同，TME可分为免疫抑制性和免疫反应性TME。

免疫抑制性TME包括以下因子和细胞：

(1) PD-1/PD-L1：PD-1是一种主要存在于免疫细胞上的重要免疫抑制分子，通常表达于T细胞、B细胞、NK细胞和髓系细胞表面。PD-L1是PD-1的两个配体之一，通常在免疫细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞）及肿瘤细胞中表达[5]。肿瘤细胞上的PD-L1与免疫细胞上的PD-1结合，通过抑制TILs的活化，诱导肿瘤细胞通过免疫逃逸而存活。

(2) 调节性T淋巴细胞（Tregs）：Tregs是参与免疫抑制的淋巴细胞系，以转录因子叉头框P3（forkhead box P3, Foxp3）表达为特征。Foxp3+ Tregs是TNBC中claudin-low亚型TILs的主要细胞类型，可通过多种机制抑制免疫反应，例如诱导效应T细胞凋亡、产生免疫抑制细胞因子和表达免疫检查点分子。

(3) TAMs：TAMs通过释放细胞因子、趋化因子和生长因子等，形成免疫抑制性TME，从而促进乳腺癌的发生、血管生成、侵袭和转移[6]。体内外研究表明，TAMs通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路促进TNBC肿瘤细胞的增殖[7]。

(4) 髓源性抑制细胞（MDSCs）：MDSCs是免疫抑制网络的重要组成部分。MDSCs通过表达免疫检查点分子、消耗必需氨基酸以导致T细胞耗竭以及产生活性氧而抑制T细胞和NK细胞的活性[8]。此外，MDSCs还参与形成转移前生态龛，并在转移性乳腺癌患者的外周血中富集[9]。

(5) CAFs：CAFs通过分泌生长因子、产生更多的细胞外基质、协助癌细胞耐药以及创造免疫抑制性TME来促进肿瘤的进展。在TNBC中，CAFs可诱导脂质相关巨噬细胞的形成并介导免疫抑制反应[10]。

免疫反应性TME包括以下细胞：

(1) CD8+ TILs：CD8+ TILs具有杀伤细胞内病原体和肿瘤细胞的细胞毒性能力，在诱导免疫反应中发挥重要作用。

(2) NK细胞：NK细胞是先天免疫系统的关键成分之一，是一种细胞毒性淋巴细胞，能够增强TNBC的抗肿瘤免疫功能。NK细胞是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的主要效应因子，也是基于抗体的治疗靶点。体内和体外研究表明，组织因子靶向抗体-免疫偶联物及嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞对TNBC细胞具有直接杀伤作用[11]。

(3) M1型巨噬细胞（经典巨噬细胞）：M1型巨噬细胞具有促炎、激活免疫应答、抑制肿瘤生长的作用。研究显示，M1型巨噬细胞与更好的临床结局相关[12]。

肿瘤细胞或免疫细胞上的PD-L1与T细胞PD-1受体结合后：

(1) 通过诱导T细胞凋亡、抑制T细胞的增殖和细胞因子的释放，导致T细胞功能受损；

(2) 促进CD4+ T细胞分化为Foxp3+ Tregs，从而增强免疫抑制作用；

(3) 通过抑制体内免疫平衡，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。

美国食品药品监督管理局（FDA）已批准以下PD-1/PD-L1抑制剂用于治疗：帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗和阿维尤单抗。

国家药品监督管理局（NMPA）依据KEYNOTE-522研究的结果，批准帕博利珠单抗联合化疗用于早期TNBC患者的新辅助治疗方案。在研究中，帕博利珠单抗联合化疗显著提高了病理完全缓解（pathological complete response, pCR）率至64.8%。对于早期高危TNBC患者，新辅助治疗后继续帕博利珠单抗单药治疗也是推荐方案之一。一项b期研究（KEYNOTE-012）首次证明了在既往接受过治疗的PD-L1阳性晚期TNBC患者中，单药帕博利珠单抗具有良好疗效。在32例TNBC患者中，客观缓解率（objective response rate, ORR）为18.5%[13]。

随后，II期试验（KEYNOTE-086）评估了帕博利珠单抗在既往接受治疗（A组）或未接受治疗（B组）的转移性TNBC（mTNBC）患者中的疗效。在A组中，50%的患者接受过三线以上治疗，帕博利珠单抗单药治疗的ORR仅为5%，反应平缓[14]。然而，在B组中，一线帕博利珠单抗治疗的ORR为21%，证明在未经治疗的PD-L1阳性患者中，帕博利珠单抗单药治疗表现更好[15]。上述两项研究还显示，在PD-L1阳性、TMB较低且无内脏转移的患者中，帕博利珠单抗能够提供短暂的良好疗效[16]。然而，III期试验（KEYNOTE-119）未能证明帕博利珠单抗单药治疗在mTNBC患者中优于化疗。此外，I期临床试验(NCT01375842)证实PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的单药治疗为mTNBC患者提供了临床益处[17]。然而，PD-1/PD-L1抑制剂在TNBC中的单药疗效有限，TNBC对ICls的耐药性也影响了其临床应用。

T细胞上的CD28和CTLA-4受体与CD80/CD86结合后，分别为T细胞活化提供正反馈和负反馈信号。CTLA-4是适应性免疫反应中的重要抑制因子，与活化T细胞上的CD80/CD86结合，竞争性抑制CD28的信号传递[18]。CTLA-4的上调是免疫逃逸的重要机制之一，其最重要的配体CD80/CD86在TNBC细胞系和肿瘤组织中表达。伊匹木单抗（抗CTLA-4单克隆抗体，已获批用于黑色素瘤治疗）能够显著激活分子级联反应，增强抗肿瘤免疫应答[19]。目前尚未批准CTLA-4抑制剂单独用于TNBC治疗。

由于CTLA-4和PD-L1通过不同机制抑制T细胞活性，因此联合使用CTLA-4和PD-L1抑制剂治疗TNBC患者具有可行性。度伐利尤单抗与替西木单抗（抗CTLA-4单克隆抗体）的双重阻断可激活并有效扩增T细胞群。PD-L1和CTLA-4抑制剂可能通过影响免疫细胞之间的串扰，诱导浆细胞在TME中产生特异性抗体，从而增强局部免疫反应以及细胞毒性T细胞的功能。这些发现表明，TNBC患者可能从度伐利尤单抗与替西木单抗联合治疗中获益[20]。

最近一项I b/II期试验（NCT03872791）显示，在治疗晚期TNBC时，采用KN046（一种靶向PD-L1和CTLA-4的双特异性抗体）联合白蛋白结合型紫杉醇的方案表现出良好疗效[21]。这一结果可能预示着双特异性抗体时代的到来，并在一定程度上证实了两种ICIs联合用药的可行性和有效性。

某些化疗药物可通过一系列途径增强肿瘤免疫杀伤、增加肿瘤免疫原性、促进免疫杀伤细胞的浸润和活化以及减少免疫抑制细胞[22]。因此，将PD-1/PD-L1抑制剂与化疗药物联合使用是一种增强免疫治疗疗效和促进协同抗肿瘤活性的有前景方法。

一项关于早期TNBC患者的荟萃分析显示，ICIs与蒽环类药物和紫杉烷类药物联合使用可显著提高pCR率，并且相比铂类化疗药物，ICIs联合化疗药物的不良事件发生率更低[23]。

一项Ⅲ期临床试验证实，对于未经治疗的mTNBC患者，阿替利珠单抗加白蛋白结合型紫杉醇的治疗方案相比安慰剂加白蛋白结合型紫杉醇，可显著改善无进展生存期（7.5个月 vs 5.5个月）和总生存期（25个月 vs 15.5个月）[24]。此外，一项关于早期TNBC的研究显示，化疗联合帕博利珠单抗治疗的pCR率高于化疗联合安慰剂组（64.8% vs 51.2%）[25]。III期试验（KEYNOTE-355）显示，帕博利珠单抗联合化疗的一线治疗可以显著延长PD-L1阳性晚期TNBC患者的无进展生存期[26]。因此，对于表达PD-L1的晚期TNBC患者，化疗联合ICIs比单独化疗更有效。2023年中国临床肿瘤学会乳腺癌诊疗指南已将帕博利珠单抗联合化疗药物方案在TNBC新辅助治疗中从III级推荐提升为II级推荐。ICIs联合化疗药物在TNBC治疗中的前景可观。

(1) ICls联合聚腺苷二磷酸核糖聚合酶( poly adenosine diphosphate ribosepoly-merase，PARP)抑制剂：PARP抑制剂通过阻断DNA单链损伤修复及合成致死作用杀死肿瘤细胞。奥拉帕利(PARP抑制剂)通过激活肿瘤cGAS/STING通路诱导依赖性促炎细胞因子的产生来促进CD8+ T细胞浸润和活化，为PARP抑制剂联合免疫疗法治疗TNBC患者提供了理论依据。在临床试验中，ICIs联合PARP抑制剂的疗效取得了令人惊喜的成绩。一项I/II期临床试验(MEDIOLA 试验)评估了奥拉帕利联合度伐利尤单抗治疗胚系BRCA 基因突变转移性乳腺癌的疗效。结果显示，10例接受ICls联合奥拉帕尼治疗的TNBC患者的中位缓解持续时间长于单用奥拉帕利[27]，该联合用药方案耐受性良好，免疫治疗相关不良事件的发生率未见上升，未报告肺炎或骨髓增生异常综合征。TOPACIO/KEYNOTE-162 试验(NCT02657889)纳入了47例既往接受过一线治疗的晚期TNBC患者，在使用帕博利珠单抗联合尼拉帕利治疗后， ORR和疾病控制率分别为21%和49%，在BRCA基因突变患者中更高(ORR为47%)[28]。

(2) ICIs联合抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)：ADC是一种通过化学键将特异性单克隆抗体与细胞毒性药物有效结合，靶向治疗肿瘤细胞的具有创新作用机制的新药。转移性乳腺癌通常表现出Trop-2（一种跨膜钙信号转导蛋白）水平升高，而Trop-2的高表达可促进肿瘤的生长和进展。戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan, SG)是一种新型ADC，通过一种特殊的可水解接头将抗Trop-2单克隆抗体与伊立替康的活性代谢产物SN-38结合。该ADC携带靶向Trop-2的中等毒性药物，代表了一种新的癌症治疗方法。SG已被FDA批准用于接受过二线或以上治疗的晚期TNBC患者，中国临床肿瘤学会乳腺癌诊疗指南2022版中，SG被纳入TNBC晚期解救治疗。目前正在进行临床试验，以评估SG联合帕博利珠单抗用于转移性TNBC (mTNBC)一线治疗的潜力。维泊妥珠单抗是一种以微管抑制剂单甲基奥瑞他汀E为有效载荷、靶向锌转运蛋白LIV-1的ADC。在Ⅰb/Ⅱ期试验(NCT03310957)中，评估了其与帕博利珠单抗联合治疗晚期TNBC的安全性和有效性。试验初步纳入的51名患者表现出可接受的不良反应和可控的安全性[29]。

(3) ICIs联合血管生成抑制剂:抗血管生成治疗可以通过增加肿瘤组织中的免疫细胞浸润和PD-L1表达，重塑免疫TME。基于血管内皮生长因子(VEGF)的免疫抑制特性，ICIs与抗血管生成药物的多种组合正在进行临床试验。Ⅱ期临床试验(NCT03394287)研究了卡瑞利珠单抗联合阿帕替尼治疗晚期TNBC的疗效。研究表明，低剂量联合治疗显示出良好的耐受性和疗效，客观缓解率(ORR)高于单药治疗[30]。二者联合用药在改善TNBC患者晚期缓解率和生存期方面具有重要作用，成为潜在治疗策略。

(4) ICIs联合磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂/蛋白激酶B(AKT)抑制剂：TNBC的不同亚型具有特定的PI3K通路突变或改变。例如，PIK3CA和AKT1突变更常见于雄激素受体阳性TNBC[31]。PI3K/AKT/PTEN通路突变的肿瘤细胞通常免疫原性较低，并由于抗炎细胞因子的释放（如VEGF）、细胞毒性T细胞耗竭以及干扰素-γ和颗粒酶B的表达降低，对PD-1/PD-L1抑制剂治疗往往产生耐药性。Song等[32]设计了一种含PI3K-γ抑制剂eganelisib和紫杉醇的白蛋白纳米颗粒，并联合α-PD1治疗转移性乳腺癌小鼠，成功实现了小鼠的长期缓解。Ⅰb期试验(NCT03800836)结果显示，联合AKT抑制剂帕他色替、阿替利珠单抗及紫杉醇或白蛋白结合型紫杉醇作为mTNBC一线治疗的疗效良好。

一项联合放疗和PD-L1抑制剂治疗乳腺癌和结肠癌小鼠模型中的研究显示，二者联合治疗可以有效诱导CD8+T细胞反应，优化免疫TME并抑制肿瘤生长[33]。一项关于17例mTNBC患者的Ⅱ期临床试验(Simon2)显示，帕博利珠单抗联合放疗的ORR为33%，而单药治疗的ORR为18.5% [34]。放疗联合免疫治疗可以增强和维持原发性和转移性肿瘤的抗肿瘤免疫反应，但需要更多的研究来确定放疗的最佳放疗剂量和分次照射方式。

新抗原是指癌症中的体细胞突变而产生的肿瘤特异性新蛋白，这些新抗原具有强免疫原性的特征。新抗原在肿瘤细胞上选择性表达，而不在正常细胞上表达，具有高度特异性。基于新抗原的免疫疗法已在乳腺癌中开展研究。与其他乳腺癌亚型相比，TNBC具有更高程度的新抗原，乳腺癌疫苗可能是新抗原的潜在应用之一[35]。ICls与肿瘤疫苗结合，通过诱导T细胞的激活以及阻断免疫抑制途径来产生更强的抗肿瘤免疫反应。PD-1/PD-L1抑制剂与基于树突状细胞的疫苗组合已被证明在小鼠乳腺癌模型中产生有效的抗肿瘤活性并延长生存[36]。目前已开展临床试验(NCT03606967)评估在mTNBC患者中联合使用度伐利尤单抗、化疗药物和新抗原疫苗的治疗效果。

OV是一类具有自我复制能力的病毒，通过利用肿瘤细胞中抑癌基因的失活或缺陷在肿瘤细胞中大量复制，从而引起肿瘤细胞的裂解和死亡。OV与ICIs联合使用的有效性已在TNBC模型中得到证实[37]。Niavarani等[38]使用水疱性口炎病毒与PD-1抑制剂联合治疗TNBC小鼠，可提高小鼠存活率。大多数OV具有良好的安全性和耐受性，副作用少。然而OV目前仍处于TNBC治疗的起步阶段，缺乏可靠的临床数据。

ACT是一种从肿瘤患者身上分离出的免疫活性细胞，通过在体外扩增、修饰和表征一系列方式增强杀伤功能后输注回患者体内，以直接杀死肿瘤细胞或间接刺激免疫反应杀死肿瘤细胞的疗法。ACT中过继性TILs、表达修饰T细胞受体或CAR-T细胞等疗法目前研究最热，而过继性NK细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)等疗法也越来越多。最新研究显示，将含有CAR-T细胞的纤维蛋白凝胶应用于TNBC小鼠部分肿瘤切除后的手术伤口后，CAR-T细胞可显著消除残留的肿瘤细胞并延长小鼠生存时间[39]。这说明CAR-T细胞治疗可能作为一种提高TNBC手术的效率和成功率的新辅助方法。在一项纳入90例TNBC患者的临床研究中，输注CIK治疗联合化疗是预防TNBC患者疾病复发和延长生存期的有效治疗策略[40]。然而，在TNBC领域，这种治疗方法仍处于早期试验阶段。

免疫疗法为一些TNBC患者的治疗增加了新的选择。以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的ICls，通过改善免疫抑制性TME和恢复免疫杀伤细胞对癌细胞的识别和杀伤作用，可有效改善TNBC患者的预后。单独使用ICIs治疗TNBC患者疗效有限，当联合其他治疗方案时能更好地增强肿瘤免疫反应、提高肿瘤治疗效果。迄今为止，免疫疗法联合常规化疗作为PD-L1阳性mTNBC的一线治疗方案疗效显著，尤其是ICls联合白蛋白结合型紫杉醇治疗。

总体而言，联合治疗是未来的发展方向，但联合治疗的方案、剂量、顺序和持续时间需要进一步探索，尤其需注意减少不良反应和提高经济适用性。随着免疫治疗领域临床前和临床研究越来越多地开展，期望能扩大适用于免疫治疗的患者，给予最合适的免疫治疗或免疫联合治疗方案，准确评估治疗效果，以最小的毒性损伤达到最佳治疗效果。