文章精选 | 上海海洋大学王有基团队 – 全氟辛酸和纳米二氧化钛损害厚壳贻贝的足丝性能

第一作者：孙炳艳，尚跃勇

通讯作者：王有基教授

通讯单位：上海海洋大学

论文DOI：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.134062

图片摘要

成果简介

近日，上海海洋大学水产与生命学院王有基教授Journal of Hazardous Materials 上发表题为“Perfluorooctanoate and nano titanium dioxide impair the byssus performance of the mussel Mytilus coruscus”的研究论文。本研究探究有机污染物（全氟辛酸）和颗粒污染物（纳米二氧化钛）对双壳类动物（厚壳贻贝）足丝防御功能的影响，通过采用扫描电镜、组织学和基因定量等手段深度解释了全氟辛酸和纳米二氧化钛对足丝性能、足形态、足部细胞凋亡水平以及足丝分泌蛋白的作用模式。

引言

全氟辛酸（PFOA）和纳米二氧化钛（nano-TiO2）分别作为有机污染物和纳米颗粒污染物，对海洋生物造成的影响引起了广泛关注。全氟辛酸因其高度稳定的碳-氟键，在环境中难以降解，导致其在全球环境及人类和野生动物体内普遍存在。其不仅影响脂质代谢和内分泌系统，还通过累积和分布在生物体内，对水生动物的生理功能造成损伤。纳米二氧化钛，因其独特的小尺寸效应、表面效应等，在多个领域得到广泛应用，但其潜在的环境风险也逐渐显现。通过食物链传递，纳米二氧化钛能在水生生物内部积累，并在高浓度下对海洋生态系统构成威胁。厚壳贻贝作为海洋食物链中的一个重要组成部分，其生存依赖于强韧、具有弹性的足丝来抵抗波浪冲击和固定在基底上。足丝不仅是贻贝附着和生存的关键结构，也是评估其防御、生存和繁殖能力的有用指标。全氟辛酸和纳米二氧化钛的存在，通过改变足丝的物理和化学性质，如影响足丝的数量、长度、直径以及力学性能，从而损害贻贝的附着能力和生存状态。这些污染物的影响不仅限于贻贝个体，还可能通过影响贻贝足丝的性能，进而影响整个海洋生态系统的稳定性和健康。探究全氟辛酸和纳米二氧化钛对厚壳贻贝足丝影响的研究，不仅可以深化我们对这些污染物生态毒理效应的理解，还能为评估其在海洋环境中的风险提供科学依据。此外，这项研究也强调了在环境污染物监测和海洋生态保护策略制定中，考虑污染物对海洋生物关键生理需求影响的重要性。

图文导读

图1：通过扫描电子显微镜（SEM）（A）和透射电子显微镜（TEM）（B）检测到的纳米二氧化钛的粒子形状和形态。

图2：暴露于7种处理7天和14天后，贻贝的足丝性质。（A）足丝数量（NBT）；（B）足丝长度（BTL）；（C）足丝斑块面积（BPA）。不同的小写字母表示同一时间点下0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛的三种全氟辛酸浓度间的显著差异（p < 0.05）。不同的大写字母表示全氟辛酸或纳米二氧化钛浓度在两个时间点（第7天和第14天）间的显著差异（p < 0.05）。星号表示全氟辛酸处理下，同一时间点的0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛之间的显著差异（p < 0.05）。

图3：暴露于7种处理7天和14天后，贻贝的足丝直径。（A）近端足丝直径（DPB）；（B）中段足丝直径（DMB）；（C）远端足丝直径（DDB）。不同的小写字母表示同一时间点下0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛的三种全氟辛酸浓度间的显著差异（p < 0.05）。不同的大写字母表示每种全氟辛酸或纳米二氧化钛浓度在两个时间点（第7天和第14天）间的显著差异（p < 0.05）。星号表示每种全氟辛酸处理下，同一时间点的0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛之间的显著差异（p < 0.05）。

足丝的数量和质量（强度、可伸展性和粘附性）是决定贻贝适应和生存的关键因素。本研究显示，纳米二氧化钛和全氟辛酸的共同暴露显著减少了足丝的数量、长度、中部和近端直径。纳米二氧化钛促进有机污染物在生物体中的组织富集，从而增强了污染物的生物毒性。同时，在污染物的暴露下，贻贝的能量分配发生变化以维持内部平衡，需要在免疫和防御等多个功能之间重新分配能量。这可以解释为纳米二氧化钛增强了全氟辛酸在贻贝体内的生物积累，增加了对生物体的生物毒性，导致足丝分泌的能量分配减少。能量被转移到解毒和其他活动上，因此减少了用于移动和附着的足丝的生产数量、长度和直径。这些结果与在不利环境条件下（如低氧、酸化和污染物，例如多溴联苯醚-47）观察到的贻贝足丝性能下降相一致。然而，在本实验中，纳米二氧化钛的暴露并未对足丝的数量和形态造成显著变化，这可能是由于贻贝暴露于纳米颗粒的方式有所不同。贻贝摄入了更多来源于食物的纳米颗粒，并对直接暴露于水中的纳米二氧化钛具有选择性。

图4：暴露于7种处理7天和14天后，贻贝足丝力学性能。（A）粘附力；（B）足丝断裂力（N）。不同的小写字母表示同一时间点下0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛的三种全氟辛酸浓度间的显著差异（p < 0.05）。不同的大写字母表示全氟辛酸或纳米二氧化钛浓度在两个时间点（第7天和第14天）间的显著差异（p < 0.05）。星号表示全氟辛酸处理下，同一时间点的0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛之间的显著差异（p < 0.05）。

足丝斑块可以附着于基底上，形成稳定的结构。研究结果显示，纳米二氧化钛和全氟辛酸的高浓度共同暴露显著降低了足丝板的粘附性和断裂力。足丝斑块中3,4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）残基与金属离子之间的相互作用在足丝的组装和固化中起着关键作用。这些相互作用可以在体外自发氧化和交联。金属氧化物纳米颗粒可以诱导氧化应激并释放相应的游离金属离子，而DOPA残基的氧化可以减少足丝斑块的粘附性。纳米二氧化钛和全氟辛酸都会诱发氧化应激反应，纳米二氧化钛释放相应的游离金属离子。这种相互作用显著影响了通过DOPA途径介导的固有粘附特性。

图5：足丝斑块和足丝断面的扫描电子显微镜（SEM）图像。对照组（A和B）。DMSO组（C和D）。0.2μg/L 全氟辛酸组（E和F）。200μg/L 全氟辛酸组（G和H）。0.1mg/L纳米二氧化钛组（I和J）。0.2μg/L 全氟辛酸 + 0.1mg/L纳米二氧化钛组（K和L）。200μg/L 全氟辛酸 + 0.1mg/L纳米二氧化钛组（M和N）。白色矩形标示了足丝的不同断面。

图6：经过14天的7种处理后，足丝斑块的不平整度百分比和足丝断面的整洁度百分比。（A）粘附力；（B）足丝断裂力（N）。星号表示在全氟辛酸处理中，0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛在同一时间点之间的显著差异（p < 0.05）。图8：经过14天的7种处理后，每组贻贝足部的组织损伤百分比。（A）纤毛损伤；（B）组织密度降低；（C）肌肉纤维减少。星号表示在全氟辛酸处理中，0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛在同一时间点之间的显著差异，其中*表示显著差异（p < 0.05）。不同的小写字母表示在同一时间点下0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛的全氟辛酸浓度之间的显著差异（p < 0.05）。星号表示在全氟辛酸处理中，0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛在同一时间点之间的显著差异（p < 0.05）。

在纳米二氧化钛和全氟辛酸的共同暴露下，足丝斑块显示出表面损伤和不均匀性，支持了这一发现。足丝斑块可以通过足部蛋白（如mfp-3、mfp-5和mfp-6）的分泌直接粘附在物体表面，而其他足部蛋白则在内部自发组装成足丝（如mfp-2和mfp-4）。我们推测足丝斑块的不均匀断裂表面是由于蛋白质合成不足或在交联组装过程中排列不当所致。此外，在纳米二氧化钛和高浓度全氟辛酸的同时存在下，足丝的断裂力减小，这归因于产生了明显更细的足丝。与此同时，足丝断裂表面的均匀性比例增加，充分表明足丝的弹性和粘附性已受到影响。贻贝足丝表面覆盖有2-5微米的保护性角质层，其硬度是胶原纤维的4-6倍。角质层的硬度和刚度可以有效分散微损伤，并在角质层断裂前保持约120%的应变。足丝断裂表面的整洁度表明，在断裂时角质层的硬度和刚度趋于胶原纤维，这表明角质层受到了影响，导致其硬度和刚度下降。这可能是由于纳米颗粒嵌入角质层，导致其固化受到干扰。

图7：贻贝足部组织切片的光学显微镜图像。（A）对照组。（B）0.2μg/L 全氟辛酸组。（C）200μg/L 全氟辛酸组。（D）0.1mg/L纳米二氧化钛组。（E）0.2μg/L 全氟辛酸 + 0.1mg/L纳米二氧化钛组。（F）200μg/L 全氟辛酸 + 0.1mg/L纳米二氧化钛组。红色箭头表示足部区域纤毛的损伤。黑色指示代表肌肉纤维。黑色矩形表示组织间密度减少。

图8：经过14天的7种处理后，每组贻贝足部的组织损伤百分比。（A）纤毛损伤；（B）组织密度降低；（C）肌肉纤维减少。星号表示在每种全氟辛酸处理中，0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛在同一时间点之间的显著差异，其中*表示显著差异（p < 0.05）。不同的小写字母表示在同一时间点下0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛的三种全氟辛酸浓度之间的显著差异（p < 0.05）。星号表示在每种全氟辛酸处理中，0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛在同一时间点之间的显著差异（p < 0.05）。

足部的足丝腺是合成和组装足丝的重要部分，足丝在足丝腺中被合成。环境污染物的存在损害了足的结构，影响其正常的生理行为。研究结果表明，贻贝足部结构受损，表现为足丝的伸展性降低，暗色纤维受损，以及组织结构的松散分布。这可以解释为足部的收缩和伸长在拉伸足丝、控制足丝长度以及调节足丝分子的正确折叠和排列中起作用。先前的研究表明，饥饿压力会导致足部足丝腺的萎缩，影响足丝的结构和强度。我们推测，纳米颗粒污染物和有机污染物造成的生理压力可能会损伤贻贝足部收缩、蠕动和分泌的个体过程。纳米二氧化钛和全氟辛酸可以附着在纤毛上，影响足的结构，影响足丝的产生，并影响足蛋白的合成和传输，导致足部无法伸展和足丝长度的减少。此外，由于足丝中DPB、DMB和DDB的解剖位置各不相同，它们各自具有独特的含义。与DPB相关的蛋白表现出结构的无序性和次优的方向性，主要以α-螺旋构象为特征，这赋予了显著的弹性。相反，与DDB相关的蛋白沿着线程的纵轴排列，表现出有结构的顺序，以β-折叠构象为主，赋予其优越的拉伸强度。已经阐明，在纳米二氧化钛和全氟辛酸的共同干扰下，这些部分均遭受非歧视性的不良影响。这种现象可能是由于足丝腺分泌动态的调节所致。在纳米颗粒引起的压力作用下，足部可能会收缩，影响细胞分泌和其他功能，间接影响原纤维的分泌和机械性能。然而，足部结构变化与足丝机械性能之间的关系仍不清楚，未来可能需要对蛋白质和中间体进行更多研究。

图9：经过14天的3种处理后，足部细胞凋亡的激光扫描共焦显微镜（LSCM）图像。（A）（B）（C）对照组。（D）（E）（F）0.2μg/L PFOA + 0.1mg/L纳米二氧化钛组。（G）（H）（I）200μg/L PFOA + 0.1mg/L纳米二氧化钛组。使用TUNEL或DAPI染色，如方法中所述。

此外，研究结果表明，纳米二氧化钛和全氟辛酸的共同暴露导致足部细胞凋亡水平增加，较高浓度的PFOA与较低浓度相比导致更高的细胞凋亡水平。细胞凋亡被认为是沿海地区环境压力的潜在指标，它涉及染色体DNA的碎片化，这可能由氧化应激反应诱发。我们假设纳米二氧化钛和全氟辛酸诱导了有毒物质的存在，促进足部的氧化应激反应，导致细胞凋亡以消除受损细胞。先前的研究已表明，三正丁基氯化锡、单独和与苯并[a]芘混合的微塑料以及其他物质可在双壳类动物中引起DNA碎片化和细胞凋亡。已显示全氟辛酸诱导氧化应激，导致双壳类细胞的凋亡和DNA损伤。此外，纳米二氧化钛和全氟辛酸的共同暴露显著增加了与凋亡相关的基因caspase-8的表达。此外，caspase-8与断裂力、附着强度等因素呈负相关。caspase家族是一组半胱氨酸蛋白酶，在各种环境压力下的细胞反应中启动细胞凋亡过程中起关键作用。研究表明，由于纳米二氧化钛和全氟辛酸的共同暴露，细胞凋亡在遗传水平上有所增加。已知全氟辛酸具有免疫毒性，可在海洋双壳类动物菲律宾蚬中诱导免疫毒性，导致细胞损伤。我们推测caspase-8的表达水平表明了全氟辛酸在双壳类动物足部区域引起的免疫反应或损伤，影响足丝腺内蛋白质的正常分泌。这可能需要激活细胞凋亡系统，例如清除已经发生坏死的细胞。然而，这些效应的确切过程和机制需要通过进一步的研究进行验证。

图10：经过7天和14天暴露后，不同种类和浓度污染物下基因的相对mRNA表达。（A）Caspase-8；（B）Mfp-3；（C）preCOL-NG；（D）preCOL-D。不同的小写字母表示在同一时间点下0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛的三种PFOA浓度之间的显著差异（p < 0.05）。不同的大写字母表示每种PFOA或纳米二氧化钛浓度在两个时间点（第7天和第14天）之间的显著差异（p < 0.05）。星号表示在每种PFOA处理中，0 mg/L或0.1mg/L纳米二氧化钛在同一时间点之间的显著差异（p < 0.05）。

足丝斑块由许多富含DOPA的足蛋白组成，呈现多孔的泡沫状结构，这些结构在足丝腺中形成，并由包括贻贝足蛋白mfp家族在内的蛋白质调控。具有多态性的mfp-3蛋白能够形成DOPA和4-羟基精氨酸，表现出更高的活动性和灵活性，使其能够形成更多的结合位点。DOPA的存在并不足以产生强大的水下粘附力；表面化学和接触几何形状影响吸附和表面接触过程中形成的蛋白质-表面键的强度和丰度。研究结果显示，mfp-3基因表达在全氟辛酸和纳米二氧化钛的联合暴露下显著增加，但足丝的粘附性并未增加。mfp与足丝粘附性表现出负相关。推测在纳米二氧化钛和全氟辛酸的联合暴露下增加了DOPA的氧化，从而降低了多巴胺介导的粘附力的可用性。纳米二氧化钛诱导的DOPA氧化导致粘附界面的松弛，需要通过增加mfp-3的表达来补偿，分泌更多的足蛋白以进行固定。然而，这种补偿效果不足以抵消DOPA氧化所引起的界面松弛。

前体胶原蛋白和近端线束基质蛋白是足丝内部核心蛋白束的主要组成部分，preCOL-NG和preCOL-D是足丝合成的关键蛋白基因。PreCOL-D分布在足丝的远端，特点是高韧性，而preCOL-NG位于两端，兼具高强度和弹性。这些前体胶原蛋白是足丝内部核心蛋白束的主要成分，赋予足丝高延展性和机械强度。足丝的质量决定了其防御性能。一些研究已经展示了环境因素（如海洋酸化、缺氧、污染物）对贻贝防御性能的影响，通过检查相关足丝蛋白的分泌。研究结果表明，200 μg/L的全氟辛酸和纳米二氧化钛的联合暴露上调了preCOL-D和preCOL-NG的基因表达水平。然而，相关性热图显示mfp、preCOL-D和preCOL-NG与断裂力、附着力、数量和长度之间存在负相关。我们推测贻贝试图增强粘附力和N以规避早期失效，例如那些由捕食者或波浪引起的损害。尽管如此，足丝的属性已经恶化，导致补偿性反应。然而，这种适应性机制似乎不足以将足丝属性恢复到基线或控制水平。污染物可能扰乱了这一基因的常规调控途径，包括转录后调整和蛋白质翻译修饰。增强足丝分泌的无能可能归因于足蛋白的翻译修饰被抑制，这些足蛋白以重复基序为特征。此类干扰可能会破坏后续的翻译过程或蛋白稳定性，抵消任何潜在的足丝性能提升。早期研究表明，全氟辛酸可以对蛤蜊的软组织细胞造成氧化损伤，扰乱辅助蛋白的转录和调节动态，如N-末端甲基化和乙酰化。为了全面了解贻贝在不利条件下如何上调足丝中前体胶原蛋白的合成以确保可扩展性，进一步研究DOPA富集蛋白的含量、修饰及其他中间过程是必需的。

图11：（A）展示了不同污染物水平和种类下，足丝在14天暴露后的PCA（主成分分析）结果。图中显示了变量的载荷（↑）和实验条件的得分。（B）展示了足丝中所有观察到的生物标记物的相关性分析。方框中的数字代表两个生物标记物之间的相关性。数字接近1表示两个指标之间有较高的正相关；数字接近-1表示两个指标之间有较高的负相关。

小结

全氟辛酸和纳米二氧化钛损害足丝的性能，影响其防御能力。全氟辛酸和纳米二氧化钛的联合暴露加剧了这些潜在的负面影响，通过降低足丝性能表现为NBL、BTL、DBT、粘附力和N的减少。为了在有机污染物和纳米颗粒压力下增强贻贝的反捕食和生存能力，贻贝通过调节与足丝蛋白的强度和粘附性相关的基因（如mfp和preCOL-D/NG）来补偿。同时，足丝中的病理损伤和细胞凋亡水平加剧，证实了全氟辛酸和纳米二氧化钛的存在负面影响了足丝分泌的生理过程，导致干扰了贻贝正常的足丝线分泌过程。污染物的存在影响了贻贝正常的反捕食物理防御行为和其对抗波浪的稳定生存行为，可能影响海洋生态系统的稳定性。

作者简介

孙炳艳，上海海洋大学水产与生命学院2021级博士研究生，研究方向为贝类生理生态。

通讯邮箱：18621089658@163.com

尚跃勇，上海海洋大学生物学流动站博士后，目前主要从事贝类生理生态研究，以第一作者身份在Journal of Hazardous Materials、Science of the Total Environment、Chemosphere、Marine Pollution Bulletin、Frontiers in Marine Science、Marine Environmental Research等期刊发表论文十余篇，论文被引1000余次。获批2023年度中国博士后科学基金第五批特别资助（站前），并入选2023年上海市“超级博士后”激励计划和国家资助博士后研究人员计划，Water Emerging Contaminants & Nanoplastics青年编委。

通讯邮箱：yyshang@shou.edu.cn

ResearchGate: https://www.researchgate.net/profile/Yueyong_Shang2

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