神经元核内包涵体病（NIID）是一种进展性神经退行性疾病，其特征是在多种神经元和体细胞中广泛存在嗜酸性透明核内包涵体。成人发病的NIID具有高度异质的神经系统表现，包括认知障碍、自主神经功能障碍、脑病样发作、小脑共济失调、帕金森病样症状、感觉障碍以及其他神经和精神症状。最近，研究发现NOTCH2NLC基因5′非翻译区（5′UTR）中的GGC三核苷酸重复扩展与典型的成人或青少年发病的NIID患者相关。此外，GGC扩展也在一些临床诊断为神经退行性疾病的患者中发现，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病相关疾病、成人白质脑病、特发性震颤（ET）和多系统萎缩（MSA）。
影像学研究表明，大多数报告的成人发病NIID患者在弥散加权成像（DWI）中显示皮质髓质交界处的高信号，这使其成为诊断成人发病NIID的敏感指标。此外，一些成人发病NIID患者在受到压力因素时会出现脑病样发作，也被认为是NIID的诊断标志。然而，关于成人发病NIID患者在脑病样发作期间增强磁共振成像（MRI）变化的研究较为稀少。在本研究中，我们发现35例成人发病的NIID患者中，有4例在脑病发作期间显示皮质增强和水肿现象，并总结了这些患者的临床、病理、遗传和影像学特征。
材料与方法
研究对象
研究对象来自于我们数据库中的35名成人发病NIID患者，这些患者在2017年10月至2019年12月间被确诊。纳入标准包括：(1) 通过皮肤或脑组织活检中的核内包涵体阳性结果以及NOTCH2NLC基因5′UTR中GGC重复扩展，明确诊断为成人发病的NIID患者；(2) 至少有一次增强MRI病灶。我们从患者及其家属处获取了详细的病史资料，收集了有关发病年龄、疾病进展、家族史及其他临床表现的信息。还进行了电解质、代谢毒性和炎症原因的实验室筛查。此外，部分患者通过简易精神状态检查（MMSE）和额叶评估量表（FAB）进行了认知和执行功能的筛查。采用标准表面电极法对神经进行刺激和记录，测量运动和感觉神经传导速度（NCV）。
脑部MRI
所有MRI检查均作为常规临床护理的一部分，使用3.0T或1.5T磁共振成像仪进行。常规的T1加权自旋回波（T1WI）、T2加权自旋回波（T2WI）、液体衰减反转恢复（FLAIR）、弥散加权成像（DWI）和表观扩散系数（ADC）序列按照常规程序进行。所有患者至少进行过一次增强MRI检查。
皮肤活检病理检查
在四例患者中，皮肤活检在距外踝上方10厘米的下肢部位进行。部分标本用4%甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度为4微米，使用苏木精-伊红（H&E）染色。采用抗p62抗体（sc-28359，Santa Cruz Biotechnology）进行免疫组化和免疫荧光染色。部分标本首先用2.5%戊二醛固定，随后用1%锇四氧化物固定，最后嵌入Epon 812中进行电子显微镜检查。超薄切片在电子显微镜下进行观察。为了提高核内包涵体的阳性率，进行了三次超微结构检查。
遗传筛查
通过重复引物PCR（RP-PCR）初步检测NOTCH2NLC基因中的GGC重复扩展。RP-PCR的引物混合物包含三个引物：NOTCH2NLC-F:5′-FAM-GGC ATT TGC GCC TGT GCT TCG GAC CGT-3′, M13-(GGC)4(GGA)2-R:5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC TCC TCC GCC GCC GCC GCC-3′, 和M13-linker-R: 5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′。电泳图中锯齿状的尾部模式被视为与疾病相关的重复扩展。使用荧光扩增长度PCR（AL-PCR）检测GGC重复扩展的长度。PCR混合物的成分与RP-PCR相同，除了使用50ng基因组DNA作为模板，并采用不同的引物对：NOTCH2NLC-AL-F: 5′-VIC-CAT TTG CGC CTG TGC TTC GGAC-3′; NOTCH2NLC-AL-R: 5′-AGA GCG GCG CAG GGC GGG CAT CTT-3′。PCR条件与RP-PCR相同。电泳在3500xl遗传分析仪上进行，数据使用GeneMapper软件分析。通过扩展等位基因的信号峰值计算重复次数。GGC重复扩展还在商业实验室中进行了FMR1基因的检测。
统计分析
数据使用SPSS 22.0版（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）进行分析。使用Kolmogorov-Smirnov检验评估变量的正态分布。分类变量以百分比和绝对频率表示，连续数据以中位数（四分位区间Q1, Q3）表示。组间分类变量的比较使用卡方检验或Fisher精确检验。使用非参数秩和检验比较组间的连续变量。如果p < 0.05，差异被视为具有统计学意义。
结果
临床特征
在本回顾性研究中，35例成人发病的NIID患者中有4例（11.4%）表现出皮层增强。这4例患者包括3名女性和1名男性。发病年龄的中位数为56岁（四分位数范围为53至61岁）。疾病持续时间的中位数为9年（四分位数范围为6至11年）。首次观察到增强病灶的时间中位数为8年（四分位数范围为3至11年）。初始症状包括2例患者的偏头痛、1例膀胱功能障碍和1例震颤。主要症状包括4例患者的认知障碍（100%）、头痛（100%）、发作性脑病（100%），3例患者的肌无力（75%），2例患者的膀胱功能障碍（50%）、感觉障碍（50%）、行为异常（50%）、视觉异常（50%），以及1例患者的瞳孔缩小（25%）和震颤（25%）。
根据我们内部成人发病NIID数据库，比较了具有增强病灶的4例患者和无增强病灶的31例患者的临床特征，结果列于表2中。结果显示，具有增强病灶的患者其发病年龄更年轻（p = 0.000, t = 9.328, 95% CI [4.722, 7.240]），疾病持续时间更短（p = 0.000, t = 4.563, 95% CI [3.772, 9.498]），与无增强病灶的患者相比，具有增强病灶的患者偏头痛发生率更高（p = 0.01, 95% CI [0.188, 1.332]），头痛发生率更高（p = 0.026, 95% CI [1.753, 4.530]），但其他临床和影像学特征在两组间无显著差异。
患者1：一名56岁的女性，因反复头痛11年入院。她在45岁时可能患有无先兆的偏头痛，发作时通常为单侧搏动性疼痛，每次发作持续不超过2小时，有时伴有恶心或呕吐。当时的脑MRI未发现异常。48岁时，她再次经历类似的头痛发作，但随后迅速出现发热、失语、认知障碍和意识障碍。症状在2周后完全恢复。那时的脑MRI显示无异常（图1a）。50岁时，她再次经历类似的发作，但MRI显示在枕颞叶皮层的DWI高信号（图1b）。在接下来的4年中，偏头痛的发作频率增加到每年5-6次，但未出现发热和神经功能障碍。54岁时，她再次发作头痛，并迅速发展为失语和右侧偏瘫及偏身感觉异常，但MRI显示无异常（图1c）。本次入院时，她出现颞部和眼眶区的搏动性头痛，随后发展为发热、恶心、呕吐、失语、视力模糊、右侧偏瘫及意识障碍。脑MRI提示左侧枕顶颞叶皮层水肿，DWI显示皮层高信号（图1d）。MMSE评分显示中度认知障碍。实验室排除代谢、毒性和炎症原因。肌肉活检未发现线粒体肌病、乳酸酸中毒或卒中样发作（MELAS）。脑电图（EEG）显示右半球弥漫性慢波。神经传导速度（NCV）无异常。外显子和线粒体基因组测序未发现致病突变。
图1：患者1的动态MRI变化。该患者在48岁时出现偏头痛，但脑部MRI未显示异常（图1a）。50岁时，该患者再次出现偏头痛，脑部MRI显示枕颞叶皮层DWI高信号（图1b，红圈）。54岁时，患者经历了偏瘫性偏头痛，但MRI未显示异常（图1c）。56岁时，患者出现严重的偏瘫性偏头痛，脑部MRI显示左侧枕顶颞叶皮层DWI高信号（图1d，红圈）。患者2：一名35岁的女性，具有偏头痛史，因发作性脑病就诊。她在32岁时出现一过性视力模糊及左侧视野中的光谱，几分钟后缓解。随后患者开始出现严重的右颞部搏动性头痛，伴有恶心和呕吐。头痛在服用止痛药并限制体力活动后通常持续不超过1小时。在接下来的3年中，偏头痛的发作频率从每年1-2次增加到7-8次。在35岁时，她先是出现头痛发作，随后表现出行为异常和意识障碍。脑电图显示双侧半球有散发性慢波，MRI显示皮质髓质交界处DWI高信号，以及T2/FLAIR白质的弥漫性高信号（图2a）。
患者3：一名53岁的男性，因排尿困难和记忆力下降9年就诊。44岁时，他因排尿潴留而接受膀胱造口术。一年后，逐渐出现意识障碍和记忆力下降。发作常与发热有关，伴有搏动性或爆发性头痛及呕吐，症状在1-3天内迅速缓解。MMSE评分为13，FAB评分为6，提示严重认知障碍。脑电图显示双侧半球弥漫性慢波。神经传导速度（NCV）显示下肢神经的轴索损伤。脑MRI显示皮质髓质交界处DWI高信号，以及T2/FLAIR白质的弥漫性高信号（图2b）。
图2：患者2（图2a，箭头）、患者3（图2b，箭头）和患者4（图2c，箭头）的脑部MRI显示皮质髓质交界处DWI高信号，T2加权图像显示白质弥漫性高信号。
患者4：一名61岁的女性，因震颤史和发作性脑病就诊。56岁时，她被注意到手指震颤，并在接下来的5年中逐渐发展到上肢和头部。她还报告出现搏动性头痛、记忆力下降及尿急。59岁起，她经历了多次意识障碍发作，并在1-3天内迅速缓解。MMSE评分为15，FAB评分为7，提示严重认知障碍。脑电图显示双侧半球弥漫性慢波及散发的棘-慢综合波。感觉神经传导速度（NCV）显示下肢神经髓鞘损伤。脑MRI显示皮质髓质交界处DWI高信号，以及T2/FLAIR白质的弥漫性高信号（图2c）。
图3：四例患者的增强MRI显示增强病灶沿皮质表面选择性分布（箭头）。所有增强病灶同时在DWI和T2加权图像中显示高信号（红圈）。
增强MRI变化
4例患者的增强MRI显示增强病灶沿皮层表面选择性分布，病灶大小不一。所有增强病灶均与急性脑病发作有关，并同时显示DWI、ADC和T2/FLAIR图像上的高信号。此外，增强病灶倾向于分布在皮层的后部区域。患者1在急性脑病发作时表现出显著增强的病灶，增强现象在2个月后完全消失，但3个月后病灶部位出现轻度局部皮层萎缩。初始的皮层DWI高信号病灶在2个月后完全消失，然而在患者3中，DWI高信号病灶一年后局限于皮质髓质交界处。遗憾的是，患者2和患者4未进行后续的MRI检查。考虑到这些增强病灶，所有患者在脑病发作期间均接受了甲基强的松龙和脱水治疗，并迅速恢复至基线状态。
图4：患者1在急性脑病发作时显示显著的增强病灶（图4a，箭头），2个月后增强病灶完全消失（图4b，箭头），但3个月后病灶引起局部皮质萎缩（图4c，箭头）。
病理变化
所有患者的皮肤活检中通过HE染色清晰观察到汗腺导管上皮细胞和脂肪细胞中的嗜酸性核内包涵体。这些核内包涵体在p62抗体染色中呈阳性。此外，患者1在汗腺导管上皮细胞和脂肪细胞中还同时出现了大量异常的细胞核，这些细胞核被填充了免疫阳性p62的物质，并在电子显微镜下显示为短卷曲的纤维材料。
图5：患者3的皮肤活检显示汗腺导管上皮细胞（图5a，箭头）和脂肪细胞（图5c，箭头）中有嗜酸性核内包涵体，HE染色阳性。汗腺导管上皮细胞（图5b）和脂肪细胞（图5d）的包涵体为p62阳性。此外，患者1的汗腺导管上皮细胞（图5e，箭头）和脂肪细胞（图5g，箭头）中有许多充满变色物质的异常细胞核，这些细胞核在p62染色中呈阳性（图5f，h）。
遗传突变
所有患者均被检测出NOTCH2NLC基因中的GGC重复扩展。RP-PCR结果显示，这4例患者的GGC重复次数均超过100次扩展。对照组中则未发现这种锯齿状模式。荧光AL-PCR结果显示患者的扩展等位基因超过500 bp，而未扩展的等位基因则约为200 bp。4例患者的GGC重复扩展次数分别为115、98、123和110次。
讨论
在本研究中，我们发现11.4%（4/35）的成人发病神经元核内包涵体病（NIID）患者表现出皮质增强和水肿现象。此前尚未全面总结具有此类影像学特征患者的临床表现。与未出现增强病灶的患者相比，出现增强病灶的患者发病年龄更早，病程更短。然而，由于具有增强病灶的患者数量较少，统计检验使用了非参数方法，因此这些结果仅为探索性结果，且未进行多重比较校正。
本研究中，两名患者在脑病样发作之前曾有或没有先兆的偏头痛史，且偏头痛发作与本次住院期间的脑病样发作同时发生。此外，所有出现增强病灶的患者在疾病的某个阶段都报告了严重头痛，而在无增强病灶的患者中，只有11名患者报告了轻度或中度头痛。最近，Wang等人还报道了一名青少年发病的NIID患者，其初始症状是长期偏头痛，最终发展为偏瘫性偏头痛。由于NIID的病程通常较为隐匿且进展缓慢，因此很难准确确定患者的初始症状。大多数患者直到病程后期，出现反复的脑病样发作或在DWI上表现出皮质髓质交界处的高信号时，才被怀疑为NIID。实际上，一些患者回忆称，他们在数年前曾出现一些被忽视的症状，如排尿困难、轻微的认知障碍、头痛、震颤和糖尿病。在这些症状中，成人发病NIID患者以偏头痛为初始症状尚未得到足够的重视。因此，当怀疑NIID时，医生应尽早注意患者的头痛主诉。
在本研究中，三名患者显示典型的DWI皮质髓质交界处的高信号，这为我们提供了怀疑诊断NIID的重要指示。常规MRI检查可以为成人发病NIID的诊断提供许多有价值的线索。DWI皮质髓质交界处的高信号一直引起医生对成人发病NIID的关注。此外，还有一些有助于诊断的线索，如全胼胝体的DWI高信号，或在排除CADASIL疾病后，常染色体显性遗传患者中双侧对称的T2高信号白质病变。然而，患者1仅表现为涉及顶枕-颞叶皮质的皮质水肿，而在皮质髓质交界处没有发现异常。因此，尽管DWI皮质髓质交界处的高信号对诊断成人发病NIID具有重要价值，但成人发病NIID的常规MRI表现存在一定的异质性。
关于成人发病NIID患者的增强MRI变化的描述较少，部分原因可能是大多数增强MRI检查没有发现异常。在本研究中，我们发现4名患者显示皮质表面显著的增强病灶，且这些病灶同时表现出DWI、ADC和T2图像上的高信号，并与脑病样发作有关。随着疾病的进展，这些病灶局限于某些患者的皮质下区域。有趣的是，DWI高信号和增强病灶集中在后部皮质表面，而前部皮质髓质交界处的线状DWI高信号却没有增强现象。特别是患者1，仅在皮质表面显示出显著增强，而在皮质髓质交界处没有线状DWI高信号。尽管增强病灶和DWI高信号提示皮质或软脑膜局部水肿和血管增生，但由于缺乏对这些增强病灶的病理学研究，其发病机制仍不明确。不过，这一局限性并不妨碍脱水和抗炎药物成为这些患者的潜在治疗手段。
NIID的临床表现具有高度的异质性。在本研究中，这些患者需要与散发性偏瘫性偏头痛（HM）鉴别。少数HM患者表现出皮质水肿和轻微的皮质增强现象。Wang等人报道了一名年轻男性，先后被诊断为HM和NIID，后者通过遗传学和超微结构病理学证实为青少年发病的NIID。HM的症状有时会模拟中风，常伴随头痛的中风样症状可能会导致患者意识丧失。另一种需要鉴别诊断的疾病是线粒体脑病、乳酸酸中毒伴卒中样发作综合征（MELAS），尤其是在患者1的情况下。实际上，患者1曾长期被误诊为MELAS，甚至进行了肌肉活检和线粒体基因筛查。成人发病NIID与HM或MELAS在临床和影像学特征上有较大的重叠，因此对于出现皮质增强的成人发病NIID患者，鉴别诊断应引起重视。
在皮肤活检中观察到的典型核内包涵体已被确立为成人发病NIID的主要诊断标准。在本研究中，所有患者的皮肤活检均显示出典型的嗜酸性和p62阳性的核内包涵体，这些包涵体在超微结构下表现为无膜的纤维堆积。然而，患者1的样本中同时存在大量异常的细胞核，这些细胞核中充满了p62抗体阳性的物质，超微结构观察显示其为短卷曲的纤维材料，似乎整个细胞核的内容物变成了未成熟的包涵体，伴随染色质的消失。该病理变化背后的机制需要进一步研究，但其独特的临床和病理特征引起了对患者1是否患有成人发病NIID的疑问。最终，基因筛查发现患者1和其他成人发病NIID患者在NOTCH2NLC基因的5′UTR中均存在GGC重复扩展，且患者1的GGC重复数与其他成人发病NIID患者没有差异。
最近的研究揭示，NOTCH2NLC基因中的GGC重复扩展与一系列广泛的临床谱系有关，包括成人或青少年发病的NIID患者、阿尔茨海默病、帕金森病相关疾病、多系统萎缩、特发性震颤及成人白质脑病。在这种情况下，我们认为患者1可能是一种新的NIID亚型，基于其独特的临床和病理特征，我们将其命名为成人发病NIID B型。
综上所述，对于成人发病NIID患者，应常规进行增强MRI检查。11.4%的成人发病NIID患者显示出沿后部皮层表面的皮质增强和水肿现象。这些患者可能比无增强现象的患者发病年龄更早、病程更短，且头痛的发生率更高。由于患者1的临床和病理特征特殊，可能应将其归类为新的NIID亚型，称为成人发病NIID B型。
