引言
Balamuthia mandrillaris 最早于1986年从一只因神经疾病死亡的怀孕山狒狒体内分离出来。它可以感染多种动物，包括大猩猩、狒狒、长臂猿、猴子、马和狗。Balamuthia mandrillaris在人类中的感染极为罕见，且通常具有致命性。截至目前，全球范围内报道的病例已超过200例，主要集中在美国和秘鲁。此外，亚太地区也有部分病例报告，包括日本、印度、泰国、澳大利亚和韩国。最近，中国也报告了两例病例。在本研究中，我们描述了过去20年间在我们科室收集的28例Balamuthia mandrillaris 感染病例。
材料与方法
所有病例均进行了皮肤病变的组织学检查（每名患者1至6次活检）。4例患者进行了脑组织检查（3例尸检和1例切除活检）。所有患者均进行了免疫组化研究。染色操作在 Ventana Benchmark 平台上完成，使用 Balamuthia mandrillaris 多克隆抗体（1:1000稀释度，由日本东京的 Kenji Yagita 博士提供，他最初从美国疾病控制和预防中心的 Govinda Visvesvara 博士处获得）。抗原提取通过蛋白酶K消化30分钟完成。
聚合酶链式反应（PCR）通过从每个病例的福尔马林固定、石蜡包埋的皮肤病变组织中提取的DNA进行。DNA使用 QIAamp 试剂盒（编号56404，Qiagen，Chatsworth，CA）制备。根据 Balamuthia mandrillaris 16S 核糖体RNA基因序列设计引物组（文库号AF477012）-BalF7: 5’-TGATCCAGCAATTTCGCATGT-3’和BalR150: 5’-TAACACTTGCCCTCTCCGTT-3’。PCR反应体系为20μL，含有1× Ex Taq 缓冲液、0.3单位的热启动 TaKaRa Ex Taq、400μM的每种脱氧核苷三磷酸、1μM的每种引物和2μL的DNA模板。循环条件为：95°C 预变性10分钟，40个循环，包括95°C/60秒，55°C/60秒，72°C/60秒，最后72°C延伸10分钟。
结果
一般患者特征
28例患者中，18例（64%）为男性，10例（36%）为女性。患者年龄范围为3至74岁（平均年龄27岁）；14例（50%）为儿童（<18岁）。发病年龄为1.5至68岁（平均25岁）。患者分布于中国12个省份。27例（96%）患者居住在农村，1例居住在小城市。17例（61%）患者在出现皮肤病变前有局部创伤史，11例患者的皮损为自发出现。所有患者均无免疫缺陷病史，如先天性免疫缺陷、HIV感染、器官移植或自身免疫性疾病，也未使用免疫抑制药物。一般血液检查结果，包括常规血液检查、肝肾功能检查，均为正常。
皮肤表现
所有患者的首发症状均为皮肤病变。26例患者表现为面部红色斑块。1例患者在面部、手臂和腰部出现三个独立的斑块，1例患者在手臂上出现单一斑块。所有皮肤病变均为质地坚硬的斑块，硬度从橡胶样至石质硬度不等。所有病例中均未发现明显的溃疡或脓性分泌物。
图1.皮肤 Balamuthia mandrillaris 感染的临床特征。A-C：三名患者分别表现为下巴、左脸和右脸的坚硬红色斑块；D：一名患者的肘部出现斑块。
皮肤病变的组织病理学显示真皮层存在肉芽肿性炎症伴有组织细胞、多核巨细胞、淋巴细胞和浆细胞的浸润，不同程度的纤维化也被观察到。在高倍镜下，阿米巴形态与组织细胞相似，用苏木精-伊红染色很难辨别。然而，免疫组织化学染色揭示了大量的病原体。在苏木精-伊红染色的皮肤切片中，仅鉴定出滋养体，直径范围为10至40μm。在免疫组化染色切片中，6个皮肤病变中发现了少量直径约为10至15μm的包囊。
聚合酶链式反应在27例（96%）患者中检测到特异性144 bp片段的扩增。
脑部表现
16例（57%）患者在病程中发展为脑部感染，其中8例通过影像学检查（磁共振成像，MRI）确诊，另外8例根据临床症状确诊。脑部症状包括发热、头痛、呕吐、嗜睡、癫痫、意识改变、步态不稳和语言障碍，这些症状通常在皮肤病变出现后的0.5至9年（平均3.7年）发展。MRI检查显示，不同患者的脑炎发生于不同部位，T1加权图像显示低信号，T2加权图像显示高信号，且病灶周围伴有水肿。
图2:一名患者（病例3）在治疗过程中，皮肤病变部分好转，脑炎逐渐恶化。A：2002年5月，脑部轴向MR流体衰减反转恢复序列显示右额叶少量斑片状信号增强；B：2002年11月，右额颞叶出现大片信号增强区域。该患者在脑炎发作6个月后死亡。
脑组织的病理学检查显示脑实质内的肉芽肿性炎症，并在高倍镜下发现了阿米巴的浸润。阿米巴散布在脑组织中，伴有肉芽肿和淋巴细胞的浸润。大多数阿米巴为滋养体，直径约为10-40μm。通过免疫组织化学染色对病原体进行验证。在一些区域，阿米巴围绕血管分布。在一个病灶中通过免疫组织化学染色发现了包囊。
图3:皮肤 Balamuthia mandrillaris 感染的组织病理学特征。A, B：真皮层内的肉芽肿性浸润，伴有明显的多核巨细胞；C：阿米巴表现为丰富的泡沫状细胞质、圆形细胞核和突出的核仁，易与组织细胞混淆（箭头所示）；D：抗 Balamuthia 抗体的免疫组化染色显示了大量病原体；E：一个多核巨细胞吞噬了一个阳性染色的阿米巴；F：免疫组化染色显示了两个包囊（箭头所示）。
3例脑炎患者和1例仅有皮肤病变的患者进行了脑脊液检查。只有1例患者的脑脊液中显示淋巴细胞增多，其他3例患者的脑脊液结果正常。
治疗与结果
28例患者中，27例有随访数据，1例失访。15例患者因脑部感染死亡，死亡时间发生在出现脑部症状后5天至6个月之间（平均1.4个月）。12例患者经过治疗后康复。在12名康复者中，11例仅表现为皮肤病变，只有1例出现局部脑部感染，该患者的感染脑组织被切除，并同时接受了多种药物的联合治疗。我们最常使用的药物包括林可霉素、阿奇霉素和干扰素-γ。然而，并非所有患者对这种治疗方案都有良好反应。
图4:一名患有皮肤和脑部 Balamuthia mandrillaris 感染的患者（病例8）在接受脑部手术和多种药物治疗后幸存。A：患者面部出现红色斑块；B：患者在随访4年后无疾病复发；C：治疗前的MRI显示左枕叶不规则斑片状高信号区域；D：术后MRI显示左枕骨部分缺损及左枕叶部分缺失。
讨论
Balamuthia mandrillaris 感染非常罕见，主要在北美和南美洲报告，其中美国和秘鲁是病例的主要来源。本研究是中国该罕见疾病的大规模病例系列报道。
我们首次在中国注意到这种疾病是在大约20年前。2002年，我们报告了3例皮肤病变病例，其中2例因脑部感染死亡。然而，当时我们无法确认病原体，错误地认为这些感染是细菌感染。除了我们的报道，最近中国仅描述了两例病例。鉴于中国人口众多，这种疾病显然极为罕见。
Balamuthia mandrillaris 感染的诊断仍然具有挑战性，因为大多数皮肤科医生和神经科医生对此病较为陌生，在临床实践中也极少遇到此类病例。Balamuthia mandrillaris 的阿米巴形态与组织细胞非常相似，这也是该病容易被误诊的主要原因。在我们的观察中，大多数阿米巴处于滋养体阶段，仅通过免疫组化技术才能鉴定出少量的包囊。根据我们的经验，面部的肉芽肿性炎症伴明显的淋巴细胞和浆细胞浸润提示可能存在该病，最终诊断通常通过免疫组化方法得以确立。
我们的病例中，脑炎通常在皮肤病变出现3-4年后发生，患者在出现脑炎后的数天至数月内死亡。影像学研究显示，不同患者的脑炎在大脑不同部位发生，结果与美国的报告相似。
4例患者通过脑组织病理学检查得到验证。其他脑炎病例的诊断基于脑部症状、影像学研究以及皮肤病变中阿米巴的检测。我们必须承认，这些病例的 Balamuthia mandrillaris 脑炎证据尚不充分。然而，这些患者的脑炎很可能与 Balamuthia mandrillaris 感染有关，因为如果皮肤病变未得到治愈，皮肤 Balamuthia mandrillaris 感染患者最有可能发展为脑炎。我们的患者脑脊液常规检查结果并未提示阿米巴脑炎的诊断。美国的报告显示，大多数患者的脑脊液检查显示轻度白细胞升高，淋巴细胞占优势，蛋白质水平升高，葡萄糖水平则为低至正常，但脑脊液检查无法区分 Balamuthia mandrillaris 脑炎和其他类型的脑炎。根据中国的最新报道，有两名患者通过脑脊液的下一代测序确诊。脑脊液的下一代测序是一种无创且快速的诊断阿米巴脑炎的方法，但其在早期诊断中的敏感性和特异性仍需通过大规模病例系列进行验证。
Balamuthia mandrillaris 感染有两种临床表现类型。美国的病例通常直接发展为脑炎，患者无皮肤病变，且通常在数月内死亡。而中国和秘鲁的病例通常先出现皮肤病变，数年后才发展为脑炎。临床上，中国和秘鲁的病例比美国的表现较为温和，更易被诊断，因为皮肤活检比脑活检更容易进行。此外，患者通常在仅有皮肤症状的阶段即可接受治疗，这个阶段通常持续数年，从而增加了成功治疗的机会。在我们存活的12例患者中，11例仅表现为皮肤病变，只有1例出现脑部感染。
尚不清楚为什么大多数美国患者直接发展为脑炎，而中国和秘鲁的患者则先表现为皮肤病变。一种可能的解释是，Balamuthia mandrillaris 阿米巴可能通过污染的土壤或水传播，因为在多个不同地点的土壤或水中均分离并鉴定出了该生物体。在我们的病例中，28例患者中有27例（96%）来自农村，且17例（61%）有外伤史。因此，推测这些病例中的大多数可能是通过受污染的土壤接种了阿米巴。然而，为什么皮肤病变最常出现在患者面部，而不是更容易受伤的四肢部位，这一点仍难以解释。
在我们的研究中，约50%的病例为儿童，这与秘鲁和美国的病例相似。尚不清楚为什么儿童更容易患这种罕见的感染。在我们的研究中，所有患者均无免疫缺陷，而美国的研究显示有39%的患者具有免疫缺陷。
Balamuthia mandrillaris 的治疗仍然是一个挑战。美国的一项研究显示，101例患者中只有10例（10%）存活，而在我们的研究中，27例患者中有12例（44%）存活。然而，我们较高的存活率主要归因于较低的脑部感染率。在我们病例中，只有1名存活的患者在病程中发展为局灶性脑炎，并通过切除感染的脑组织进行治疗。Doyle 等人也报道了一例通过相同方法成功治疗的病例。然而，这种方法不应作为大多数病例的首选。
我们发现，林可霉素、阿奇霉素和干扰素-γ或其组合对许多皮肤病变病例有效。然而，我们也观察到，部分患者的皮肤病变逐渐好转，但脑部感染却逐步加重。可能的原因是这些药物无法穿透血脑屏障，因此对脑炎的治疗效果较差。最近，Laurie 等人筛选了2000多种药物，发现喹啉类化合物硝喹酮在体外对 Balamuthia mandrillaris 具有良好的治疗效果。然而，目前尚无该药物治疗病例的报道。其他潜在的药物也已在体外筛选，但其临床疗效和副作用仍需进一步临床验证。
总之，我们的研究结果表明，Balamuthia mandrillaris 感染在中国极为罕见。中国的 Balamuthia mandrillaris 感染患者与美国的患者在临床特征和结局上有明显差异。皮肤科医生、病理学家、儿科医生和神经科医生在面对不明原因的肉芽肿性病变时，应警惕这种罕见疾病的可能性。
