2023年4月，来自Norwegian University of Life Sciences的Madan Junghare等人在Biotechnology for Biofuels and Bioproducts上发表了一篇题为Biochemical and structural characterisation  of a family GH5 cellulase from endosymbiont of shipworm P. megotara的研究性文章。

减少化石燃料消耗的愿望引发了人们对寻找可替代的可再生能源的巨大兴趣，包括木质纤维素生物质。植物基木质纤维素生物质是一种丰富的聚合物材料，可用于可再生能源生产，从而有助于减少化石燃料的消耗。木质纤维素由纤维素、半纤维素和果胶等多糖类物质以及木质素这种复杂的芳香族聚合物组成。纤维素是植物生物质中最重要的结构组分，据估计全球每年的产量超过1.5 × 1012吨。纤维素是葡萄糖的均聚物，通过β - 1,4 -糖苷键连接。纤维素链缔合成一种不溶的、通常是结晶的纤维结构，这使得该材料在结构上很强，对生物降解具有挑战性。与其他聚合物细胞壁化合物的分子间相互作用增加了强度和抗逆性。因此，虽然纤维素是一种有吸引力的绿色能源来源材料，但由于其抗酶解聚性，其开发是复杂的。事实上，高效转化木质纤维素生物质，甚至相对纯净的纤维素纤维，需要多种酶协同作用，对原料进行解构，生成可转化为燃料和化学品的单体糖。

酶促纤维素解聚主要由纤维素酶和溶解多糖单氧酶（LPMOs）协同催化。纤维素酶包括内切型和外切型糖基水解酶（GHs），这两种酶被认为具有协同作用，因为例如内切型β-1,4-葡聚糖酶会水解内部糖苷键，生成新的链端，而外切型β-1,4-葡聚糖酶（也称为纤维生物水解酶）可在新链端上发挥作用。尽管经过数十年的研究，人们仍然需要新型高效的纤维素酶，以帮助提高生物精炼工艺的可持续性和经济性。迄今为止，大多数具有纤维素活性的酶都是从木材腐烂真菌和土壤细菌中分离和鉴定出来的。降解纤维素的高等生物可能会利用共生微生物作为生物质降解酶的来源，如海洋船蛆，它是一种杰出的木质纤维素降解生物。在本研究中，我们分析了以海洋中的沉水木材为食的海洋木材消化双壳软体动物--船蛆。

船蛆为Myida目海洋软体动物，船蛆科为(又称'海白蚁')科海洋软体动物。它们是广泛分布于世界各大洋的钻木双壳类。它们以钻入浸没在海水中的木结构而臭名昭著，它们在那里定居并挖掘到木材中，作为幼虫，最终成长为细长的蠕虫。因此，船蛆是唯一的，因为只有少数生物进化出以木质生物质为唯一营养来源的能力。大多数船蛆种具有简单的消化系统，即一个大的盲肠和一个短的肠。先前的研究表明，船蛆可能在其肠道-消化系统(盲肠)中存在少量有助于木材消化的微生物。然而，后来有报道指出，存在于鳃组织特定区域的内共生菌在固定大气氮的同时也产生了多种碳水化合物活性酶(碳水化合物酶类)，在船蛆的盲肠中发挥木质纤维素消化功能。除此之外，船蛆还能产生一些内源性的碳水化合物酶类，由专门的消化腺分泌，最后在盲肠中积累，用于木质纤维素的消化。由于这些独特的特性，船蛆是发现新的用于木质纤维素解聚的碳水化合物酶类的一个有吸引力的目标。

对内共生菌的基因组分析结合船蛆的盲肠蛋白质组分析发现，肠道-消化系统中含有内共生菌来源的纤维素酶，这些纤维素酶分属于多个糖基水解酶( GH )家族，具有不同的底物特异性。例如，GH5是一个大的蛋白家族，它不仅含有内切葡聚糖酶( EC 3.2.1.4 )，还含有β -甘露聚糖酶( EC 3.2.1.78 )、外切- 1，3 -葡聚糖酶( EC 3.2.1.58 )、内切- 1，6 -葡聚糖酶( EC 3.2.1.75 )、木聚糖酶( EC 3.2.1.8 )、内切葡聚糖酶( EC 3.2.1.123 )和黄原酶。为了寻找新的纤维素酶，我们鉴定了一个属于糖苷水解酶家族5 ( GH5 )的纤维素酶，并对其进行了克隆、表达、功能和结构表征。该蛋白与来自船蛆内共生菌Teredinibacter waterburyi的一个假定的GH5纤维素酶基本相同，因此命名为TwCel5。该酶是一个大的多结构域纤维素酶的一部分，包括一个N端GH5结构域，三个CBM10结构域和一个C端GH6结构域。在本研究中，我们制备了GH5酶的两种变体：仅催化结构域( TwCel5CAT )和连接在C端CBM10的催化结构域( TwCel5CBM )，并进行了功能比较。在对这两种变体进行功能表征的基础上，我们还探究了GH5纤维素酶与纤维素活性细菌LPMO的Cels2之间潜在的协同作用，该作用增强了对结晶纤维素的解聚活性。结果表明，Tw Cel5是一种内切β - 1，4 -葡聚糖酶，具有催化特性，是一种潜在的纤维素生物转化工业生物催化剂。

1.序列分析和结构建模    

3312 个核苷酸序列（GenBank；OP793796）编码了一种多域蛋白质（WAK85940.1），即 TwCel5-6，由 1103 个氨基酸残基组成，具有一个用于蛋白质分泌的假定 N 端信号肽。利用Interpro进行氨基酸序列分析，将Tw Cel5 - 6蛋白分为N -末端糖基水解酶家族5 ( GH5 )结构域(氨基酸15 ~ 322)和C -末端糖基水解酶家族6 ( GH6 )结构域(氨基酸690 ~ 1103)，由368个氨基酸长区域间隔，编码3个纤维素结合CBM10模块(图1A )。这五个模块由多聚丝氨酸连接子连接，被认为是灵活的、无组织的间隔区。将Tw Cel5 - 6推导的氨基酸序列进行BLAST搜索，发现其与船蛆内共生菌Teredinibacter waterburyi中一个迄今未被鉴定的糖基水解酶( WP _ 223144885.1 )的序列一致性最高，为99.49 %。值得注意的是，后者仅由773个氨基酸残基组成，包含N端假定的GH5结构域(氨基酸15 ~ 322)和C端不完整的GH6结构域(氨基酸688 ~ 773)，中间由3个纤维素结合的CBM10模块间隔。通过Colabfold对Tw Cel5 - 6进行Alphafold2结构预测，预测到一个非结构化的N端(最有可能是信号肽)，后面的5个模块均由柔性连接子(图1B)连接。有趣的是，Alphafold模拟预测两个第一个CBM10模块含有一个二硫键，连接N端linker的末端和C端linker的起始(图1C )。

图1.TwCel5 - 6的多模块架构。全长基因编码蛋白TwCel5 - 6由信号肽( SP )、糖基水解酶5 ( GH5 )、三个家族10碳水化合物结合模块( CBMs )和糖基水解酶6 ( GH6 )催化结构域组成。B Alphafold2预测Tw Cel5 - 6的结构；非结构连接体、CBM10s和GH5和GH6催化模块分别被染成灰色、绿色、蓝色和品红色。C第1个CBM10模块的详细信息，显示连接进入和退出模块的连接器的二硫桥(黑色箭头)

除了单独的GH5催化结构域TwCel5CAT和催化结构域与一个CBM10相连的TwCel5CBM以外，尝试生产全长蛋白和几个截短的突变体均失败了(数据未显示)。TwCel5CBM和TwCel5CAT均以可溶性和活性形式表达。两种蛋白都是用亲和标签产生的；Tw Cel5CAT含有C端组氨酸标籤，Tw Cel5CAT含有N端V5 -组氨酸标籤。使用亲和层析和体积排阻层析将带His标签的酶纯化至均一。纯化蛋白的SDS - PAGE分析显示，TwCel5CAT和TwCel5CBM在 ~ 35 kDa和 ~ 45 kDa附近有单一均一的蛋白条带迁移(图2A )，这与计算的理论蛋白质量分别为33.7 kDa和44.9 kDa一致。

图2.对纯化的TwCel5进行SDS - PAGE分析。泳道1，标准分子量标记( k Da )；车道2，TwCel5CBM；车道3，TwCel5CAT。B对三种纤维素0.5 % ( w / v )底物的水解活性筛选。C为0.5 % ( w / v ) PASC降解的比较进度曲线。反应在含有0.5 M NaCl和1 µ M酶的50 mM磷酸钠缓冲液( pH 7.5 )中进行，在30 º℃下孵育。通过DNSA法测定还原糖的释放来测定水解活性.

根据CAZy数据库( GH5家族可在http://www.cazy.org/GH5.html),处获得,含有广泛的作用于包括纤维素在内的多种β -连接底物的酶。初步活性筛选实验表明, TwCel5的两个酶变体均能够水解无定形纤维素( PASC )) .然而，对于结晶的Avicel and Whatman® paper，仅观察到可忽略的水解活性( 图2B )。对结晶纤维素底物没有酶活性表明，TwCel5变体对纤维素的无定形区具有偏好性，如PASC，类似于从黑山羊瘤胃中获得的KG35 ( GH5 )内切- β - 1,4 -葡聚糖酶。这两个突变体对所有三种底物都表现出相似的活性，这有点令人惊讶，因为人们预计TwCel5CBM中CBM10的存在对不溶性底物的活性是有益的，特别是在本研究中使用的低底物浓度下。通过记录PASC的相对进展曲线证实了活性的相似性(图2C )。这一结果可能表明CBM10对PASC底物的亲和力不如纤维素，或者Tw Cel5 - 6的这一截短体不能观察到该结构域的功能。

3.对其他多糖的酶活性影响

通过测定TwCel5对9种不同的可溶性纤维素和半纤维素底物的水解活性，评估了TwCel5的底物特异性。两种变体对混合连接的β - 1，3，β - 1，4 β -葡聚糖的反应显示出最高的活性(图3 )。此外，两种酶变体对含有β - 1，4糖苷键的CMC和魔芋葡甘露聚糖也表现出(较低)活性。然而，不含CBM的酶产生的还原糖量略高。两种酶对半纤维素底物均无活性，包括木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯树胶、木葡聚糖和地衣多糖(图3 )。由此可见，这两个酶变体更倾向于选择具有β - 1，4 -连接葡萄糖单体的底物。这与之前发现的几个具有相似底物特异性的GH5酶很好地吻合。值得注意的是，该酶对由β - 1，4糖苷键连接的纯甘露糖聚合物或天然底物如桦木和云杉木粉(数据未显示)没有检测到活性。因此，在水解由β - 1，4 -甘露糖和葡萄糖残基以60：40比例组成的魔芋葡甘露聚糖时，TwCel5酶的作用靶标很可能是含葡萄糖底物之间的β - 1，4糖苷键。这些结果表明，来自船蛆P . megotara细菌鳃共生菌shipworm P. megotara bacterial gill-symbiont 的TwCel5等酶很可能在船蛆肠道中通过将β -葡聚糖水解为可用于能量代谢和生长的葡萄糖等简单糖类，从而在木质纤维素消化中发挥重要作用。这突出了船蛆的独特之处，即在细菌所在的鳃中不发生木材消化，但细菌纤维素酶最终转移到盲肠，使宿主船蛆能够直接消耗葡萄糖和其他糖类。

图3.Tw Cel5CAT和Tw Cel5CBM对纤维素和半纤维素底物的水解随时间的变化。反应在含有0.5 M NaCl和50 nM酶的50 mM磷酸钠缓冲液( p H 7.5 )中进行，30 º C孵育1 h，重复3次。以葡萄糖为标准，对还原糖当量进行了定量。结果与三次重复的平均值和标准偏差相对应

图5.p H对Tw Cel5水解活性和稳定性的影响Tw Cel5水解活性的p H依赖性表现在使用0.5 % ( w / v ) β -葡聚糖、0.5 M Na Cl和50 n M酶变体的50 m M不同缓冲体系中，30 º C孵育60 min。还原糖值是由三次重复获得的数据得出的平均值和标准偏差

此外，Tw Cel5的活性随着温度的升高而增加，在30 - 50 ° C范围内达到最大活性(图6 )。当温度高于50 ° C时，在60 min的培养时间内，酶失活的迹象变得明显，并且这种作用对于活性稍低的CBM连接的酶更强。值得注意的是，TwCel5CAT在10 ° C到60 ° C的温度范围内保留了超过50 %的水解活性，这表明该蛋白既具有冷适应性又具有一定的耐热性(图6 )。虽然，船蛆能够适应低温环境，但先前的研究表明，来自船蛆共生菌的酶表现出与TwCel5CAT相似的生化特性，例如，从船蛆Lyrodus pedicellatus中获得的纤维素内切- 1，4 - β -葡聚糖酶。另一个有趣的现象是，据我们所知，在较碱性的p H下具有活性和耐热性相结合是一种相当罕见和不寻常的酶特性。由于Tw Cel5来源于海洋船蛆共生体，存在于海水中，因此我们评估了NaCl盐浓度对酶水解活性的影响。使用标准测定条件，我们发现0 - 1.5 M NaCl浓度对酶活影响。综上所述，Tw Cel5是一个耐盐的β - 1，4 -内切葡聚糖酶，能够在较宽的pH和温度范围内发挥作用，是一个有工业应用价值的候选酶。

图6.温度对TwCel5水解活性和稳定性的影响TwCel5对β -葡聚糖的水解表现出温度依赖性，在50 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.5，使用0.5 % ( w / v ) β -葡聚糖，0.5 M NaCl和50 nM酶变体，在不同温度( 5 º C至30 º C )下孵育60 min。还原糖数值为3次重复的平均值和标准差

6.Tw Cel5与LPMO共孵育提高了水解活性

众所周知，船蛆内共生菌产生多种碳水化合物活性酶，包括纤维素活性的裂解性多糖单加氧酶( LPMOs )和多种糖基水解酶( GHs )，以完成对木材的有效消化，以获得营养和生长。最近的一项研究结合了木材降解菌船蛆Lyrodus pedicellatus的转录组学、蛋白质组学和生物化学分析，报道了编码辅助活性家族10 ( AA10 ) LPMO的基因的表达，该基因可能与内源性和内共生菌的多结构域糖苷水解酶协同作用，在β - 1，4 -葡聚糖的水解中发挥作用。因此，非常有趣的是确定来自天蓝色链霉菌A3 ( 2 )的典型纤维素活性AA10LPMO，CelS2是否会增强TwCel5CAT或TwCel5CBM的水解活性，特别是对纤维素的半结晶形式Avicel。正如预期的那样，当CelS2和TwCel5CAT或TwCel5CBM作为酶鸡尾酒组合时，在还原糖的生成上观察到了明显的协同效应(图7A )。有趣的是，在与CelS2的反应中，连接CBM10的酶TwCel5CBM比催化TwCel5CAT释放的还原糖量更高。这可能表明LPMO活性揭示了结晶底物的区域，其中CBM10部分有利于GH5的效率。值得注意的是，一个控制反应表明(图7B )，明显的协同作用不仅仅是GH5催化水解LPMO生成的更长的可溶性纤维寡聚体的结果。我们的结果补充了一些研究，表明具有纤维素活性的LPMO提高了Avicel等结晶纤维素上船蛆糖苷水解酶的活性，并支持了LPMO作用对船蛆中木材解聚消化和营养的重要性的观点。

图7.纤维素酶活性LPMO CelS2和纤维素酶TwCel5之间的协同实验显示对Avicel的水解活性增强。将TwCel5CAT、TwCel5CBM或CelS2各1 µ M单独或联合孵育不同时间，所有反应混合物中包括1 mM抗坏血酸。B将CelS2处理48 h后的微晶纤维素氧化产物与TwCel5突变体孵育18 h；"控制"是指不加酶的反应。得到的数值是由三重复得到的平均值和标准差

7.纤维素酶TwCel5CAT的结构分析

为了获得Tw Cel5CAT的结构、键裂解模式和作用方式，我们求解并确定了催化模块的三级结构。TwCel5CAT以apo形式结晶，并收集了衍射至1.0 ?分辨率的数据集(表1 )。以来自革兰氏阴性植物病原体除虫菊欧杆菌的GH5纤维素酶Cel5 ( PDB：1EGZ)的结构中的蛋白质坐标为搜索模型[ 45 ]，通过分子置换确定其结构(表2 )。将TwCel5CAT模型精修为Rwork和Rfree分别为11.42和13.30，最终模型存入PDB数据库( PDB标识符8C10)。利用DALI服务器进行结构比对，发现与甘蔗土壤宏基因组获得的GH5家族纤维素酶( PDB标识符4M1R ; 67 %的序列一致性)中的纤维素酶Cel E1和除虫菊欧杆菌中的内切葡聚糖酶EGZ ( PDB标识符1EGZ ; 67 %的序列一致性)的结构匹配度最高。

表.1数据收集与处理统计。

表2.结构确定与细化统计。括号中的值是最外层的外壳

CAZY家族GH5亚家族2的第一个三维结构是从苏打湖中发现的一株碱性芽孢杆菌中分离得到的纤维素酶。与定义的家族成员一致，TwCel5CAT表现出经典的( β / α ) 8桶状折叠(又称TIM -桶;图8A)，具有两个保守的谷氨酸；催化中心中的Glu157和Glu245 (图8B )被定位为促进第5家族纤维素酶特征的预期置换机制。因此，从与其他GH家族5纤维素酶的同源性来看，其质子供体为Glu157，亲核试剂为Glu228。此外，TwCel5CAT的底物结合裂缝与其他2分支GH5酶相似，显示出参与底物结合的保守芳香族和极性氨基酸(图8C )。与其他大多数GH5s亚家族2不同的是，Tw Cel5 CAT在还原性末端亚位点的外侧区域有一个色氨酸( Trp226 ) (图8D )。在GH5s亚家族2的15个独特结构中，只有3个在该位置有一个Trp，即来自泥土芽孢杆菌(geobacillussp.)的耐热Gs Cel A。70PC53，从土壤宏基因组中克隆的耐盐基因Cel5R和从C . hutchinsonii中克隆的Cel5B。值得注意的是，TwCel5CAT的Alphafold2模型与X射线晶体结构的比较表明，C α -碳的RMSD仅为0.35 Å (图S3A )。此外，保守的活性位点和底物结合裂缝中氨基酸的侧链被模拟到接近完美的。

图8.TwCel5CAT的晶体结构解析。TwCel5CAT三级结构的正交图显示出特征的( β / α ) 8 -桶状折叠。螺旋为蓝色，β链为青色，环为白色。Mg2 +和K +离子分别显示为绿色和紫色的球体。B Tw Cel5CAT的假定活性位点，侧链为Glu157和Glu245，呈黄色碳。C蓝色碳点表示可能与底物相互作用的氨基酸侧链与底物结合的情况。为了说明问题，我们通过将Tw Cel5 CAT结构与来自Bacillus agaradharens ( PDB标识符: 1H5V)的含有Cel5A的配体结构进行结构叠加，在底物结合位点上放置了一个硫代纤维五糖分子。D将TwCel5CAT和B . agaradharens Cel5A的决定氨基酸的亚位点进行结构叠加，突出了TwCel5CAT中假定的 + 3亚位点。Tw Cel5CAT，蓝色碳；Cel5A、灰碳；基质，绿色碳

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结论

DOI:https://doi.org/10.1186/s13068-023-02307-1