2024年1月,来自中国海洋大学的Jiajing Li等人在International Journal of Biological Macromolecules上发表了一篇题为Characterization and elucidation of a novel M-specific alginate lyase Aly7Aq with strict recognition at subsites±2的研究性论文。
Abstract
通过生物信息学和分子生物学相结合的方法,克隆并异源表达了一种新型褐藻胶裂解酶Aly7Aq。Aly7Aq是一种M型特异性褐藻胶裂解酶,其最适反应条件为50℃和pH10.0。经测定,Aly7Aq能以随机内切方式降解多糖。最小反应底物为四糖,Aly7Aq主要作用寡糖底物还原端的第3个糖苷键。Aly7Aq的二糖产物为ΔM,三糖产物为ΔMM和ΔMG,这与之前所有具有M特异性的褐藻胶裂解酶都不同。降解产物表明,Aly7Aq的±2亚位点严格识别M单位,而-1亚位点则可同时识别M和G单位。因此,Aly7Aq的底物特异性来自于±2亚位点的特异性。这是首次报道M特异性褐藻胶裂解酶±2亚位点的特异性。新型M特异性Aly7Aq可作为特异性降解褐藻胶和定向制备寡糖的潜在工具。
01
简介
褐藻胶是一种海洋酸性多糖,由β-D-甘露糖醛酸(M)及其C5表聚物α-L-古洛糖醛酸(G)组成。这两个残基在褐藻胶中通过1,4糖苷键连接,形成三种类型的同聚糖醛酸片段:M-嵌段、G-嵌段和MG-嵌段。褐藻胶因其多种生物特性,尤其是形成凝胶的能力,被广泛应用于食品、制药、纺织和环保领域。同时,由褐藻胶降解产生的褐藻胶寡糖因其突出的生理活性而被视为具有发展前景的生物活性成分。
褐藻胶裂解酶通过β-消除机制切割褐藻胶糖苷键,并在非还原端产生具有4-脱氧-L-赤藓糖-4-烯吡喃糖基糖醛酸单元(Δ)的不饱和双链。褐藻胶裂解酶是褐藻胶及其寡糖研究的重要工具,广泛应用于食品、医药、生物燃料等领域。特别地,褐藻胶裂解酶被认为是生产寡糖的绿色和有效工具。不同结构的褐藻胶寡糖具有不同的功能活性。甘露糖醛酸寡糖(MOS)具有较好的抗菌活性和免疫调节作用。通过褐藻胶裂解酶降解得到了不同分子量的寡糖,其中MOS表现出更宽的光谱和更强的抑制作用。研究表明,具有较高M/G比的褐藻胶寡糖在RAW 264.7细胞中表现出更强的诱导(TNF)-α分泌的能力。同时,MOS的衍生物也表现出显著的神经保护、降血脂和降血糖特性。具有特定结构的MOS及其衍生物的活性研究已引起人们的广泛关注。
M-特异性褐藻胶裂解酶可用于定向制备定制结构的MOS,在MOS的研究中具有重要意义。目前,已鉴定了20种以上的内切M-特异性褐藻胶裂解酶。然而,<10M-特异性褐藻胶裂解酶已经表征了其产物的结构。M-特异性褐藻胶裂解酶的产物结构和作用方式有待于进一步研究,以更好地应用于多糖降解和寡糖制备。
在本研究中,克隆并表达了一种新的M-特异性褐藻胶裂解酶。对该酶的底物专一性和酶学性质进行了研究。通过使用色谱技术的组合,鉴定了寡糖产物的结构,并阐明了作用模式。该酶的研究为褐藻胶寡糖的靶向制备及褐藻胶的进一步研究提供了一种生物技术手段。
02
结果与讨论
1.Aly7Aq的克隆、表达和纯化
PL7潜在的褐藻胶裂解酶Aly7Aq(GenBank AXT61430.1)来源于Aquimarinasp.AD10。Aly7Aq由394个氨基酸残基组成,并被预测含有N-末端信号肽(1-32个氨基酸)和PL7家族催化结构域(201-384个氨基酸)(图1A)。进化关系分析表明,该序列位于PL7褐藻胶裂解酶的分支的深处(图1B)。BLASTP分析显示,该酶与来自Nitratiruptorsp. SB155-2的褐藻胶裂解酶NitAly(GenBank BAF 69299.1)表现出最高的相似性(35.45%),表明Aly7Aq的新颖性。
图1.Aly7Aq的结构域(A)和Aly7Aq的系统进化分析(B)。
重组蛋白Aly7Aq经克隆、表达和纯化,褐藻胶酶活力为0.41U/mg。Aly7Aq不能降解其他多糖醛酸,包括果胶、透明质酸和硫酸软骨素。基于SDS-PAGE上的单一条带,确定Aly7Aq的Mw为45.0kDa,这与预期值41.0kDa一致(图2)。Aly7Aq是PL7家族的一种褐藻胶裂解酶。
图2.纯化的重组Aly7Aq的SDS-PAGE。
2.底物特异性
在最适反应条件下,Aly7Aq对褐藻胶、PolyM和PolyG的酶活分别为0.41±0.01U/mg、0.89±0.02U/mg和0U/mg。褐藻胶底物的Km、Vmax、kcat和kcat/Km被确定为4.06mg/mL、2.65U/mg、1.81s-1和0.45μM-1s-1,而PolyM底物的这些动力学参数分别为0.72mg/mL、2.02U/mg、1.38s-1和1.90μM-1s-1。Aly7Aq对PolyG无活性,对PolyM表现出更好的活性和亲和力。这表明Aly7Aq是一种M专一性的褐藻胶裂解酶。此外,使用HPLC-RID分析检测Aly7Aq与褐藻胶、PolyM、PolyG孵育的反应。在与PolyG的孵育中未观察到底物分子量的急剧降低,表明Aly7Aq不能降解PolyG。Aly7Aq被鉴定为M-特异性褐藻胶裂解酶的新成员。
通过AlphaFold2预测Aly7Aq的结构,并将褐藻胶四糖模型M4和G4对接到Aly7Aq中。Aly7Aq与M4和G4的结合能分别为−9.6kcal/mol和−6.2kcal/mol。基于对PL7家族褐藻胶裂解酶的丰富结构研究,His/Tyrβ-消除是PL7褐藻胶裂解酶最常用的催化机制。确定了M特异性褐藻胶裂解酶AlyC3中催化过程的关键残基。关键残基His127、Tyr244、Arg78和Gln125介导催化反应,而残基Arg82、Tyr190、Lys171和Gln246在糖链的结合和定位中起作用。根据对接结果,M4更适合放置在具有催化活性位点的槽中。His254、Tyr347、Arg216和Gln252都靠近M4分子,催化酸Tyr347和催化碱基His254与-1亚位点的O4和+1亚位点的C5之间的距离分别为3.1nm和3.5nm(图3A)。而,残基Gln252和Lys287远离G4分子,Tyr347和His254与-1和+1亚位点的距离分别为4.7和6.2(图3B)。G4的结合能低于M4,且G4离催化空腔中的关键残基较远。分子对接结果与Aly7Aq的M特异性一致。
图3.Aly7Aq与四糖配体M4(A)和G4(B)的对接模拟。配体M4和G4显示为粉红色和蓝色棒。催化腔中的关键残留物显示为突出显示的棒状物。催化残基和配体之间的距离用红色标签标记。
3.生化特性
Aly7Aq的最适反应温度为50℃(图4A)。在20-60℃的温度范围内,Aly7Aq表现出>60%的最大活性,表明其能够在宽的温度范围内进行反应。值得注意的是,许多M特异性褐藻胶裂解酶在40-55℃的温度下表现出最大活性,Aly7Aq表现出类似的高最适反应温度。Aly7Aq在4℃下储存24小时后保留>75%的最大活性,但在>35℃的温度下迅速失活(图4B)。Aly7Aq在20mMNa2CO3NaHCO3缓冲液中在pH10.0时最具活性(图4C),在3.0至11.0的pH范围内保持>80%的最大活性(图4D)。
图4.Aly7Aq的生化特性:(A)最适温度;(B)热稳定性;(C)最适pH;(D)pH稳定性;(E)NaCl浓度的影响;(F)金属离子和化学物质的影响。
Aly7Aq在不添加NaCl的情况下保持降解活性(图4E)。添加0.1-0.5M的NaCl能显著提高Aly7Aq的酶活,这可能是由于Aquimarinasp.AD10的原生环境是海洋,而海洋的高盐环境导致了NaCl对Aly7Aq酶活的增强。重金属离子Cu2+、Mn2+、Cr3+和化学试剂SDS、EDTA Na2、β-巯基乙醇对Aly7Aq的活性表现出显著的抑制作用(图4F)。
4.对多糖的作用模式
在酶剂量为0.2U-0.6U的Aly7Aq与褐藻胶孵育反应的初始阶段,在不存在单糖的情况下产生各种不饱和寡糖(图5A),这表明Aly7Aq以随机内切方式降解多糖。使用提取离子色谱图(EIC)的峰面积计算寡糖的丰度。随着酶剂量的增加,DP≤3的寡糖不断积累,而DP≥4的寡糖先增加后减少(图5B)。表明Aly7Aq的最小底物为四糖。
5.对寡糖的作用模式
利用UPSEC-VWD-MS分析,同时检测了Aly7Aq与饱和寡糖孵育反应中的饱和和不饱和产物。仅当饱和的寡聚甘露糖醛酸盐用作底物时观察到产物(图6A、B),证明Aly7Aq是M特异性酶。只有DP≥4的寡聚甘露糖醛酸被降解,表明Aly7Aq的最小反应底物是四糖,这与第3.4节中多糖降解的分析一致。M4的降解产物为M和ΔMM,M5的降解产物为MM和ΔMM。M6的产物含有大量的MMM和ΔMM,以及少量的MM和ΔMMM(图6C)。结果表明,在降解过程中,四糖与Aly7Aq的-1至+3亚位点结合,而五糖与-2至+3亚位点结合。同时,六糖主要结合在-3到+3的亚位点上,少量结合在-2到+4的亚位点上(图6D)。在寡聚甘露糖醛酸的降解过程中,Aly7Aq主要攻击寡糖底物还原端的第三个糖苷键。
作用模式是酶最重要的特性之一。研究发现,有六种内切M-特异性褐藻胶裂解酶已被阐明了它们对寡糖的作用模式。BcelPL6优先降解从还原端开始的第二个糖苷键,而其余五种酶主要降解第三个糖苷键,包括褐藻胶裂解酶AlyC3、AlxM、HdAly、AkAly28和AkAly33。Aly7Aq也主要切割从还原端开始的第三个糖苷键,这表明M-特异性褐藻胶裂解酶对寡糖的作用模式相似。
产物分布受褐藻胶裂解酶对寡糖底物的作用方式的影响。BcelPL6终产物中最丰富的寡糖是褐藻胶二糖,而HdAly、AkAly28和AkAly33中最丰富的寡糖是三糖。值得注意的是,虽然Aly7Aq表现出与HdAly、AkAly28和AkAly33相同的作用模式,但Aly7Aq最丰富的寡糖与它们不同。Aly7Aq产物中含量最高的寡糖是四糖(42.1%),其次是三糖(35.0%)。可能的原因是当以六糖为底物时,Aly7Aq也可以切割还原端的第四个糖苷键。因此,在反应期间产生了显著量的褐藻胶四糖产物。
6.产物的鉴定和特异性
利用HPAEC-PAD/MS方法对Aly7Aq与褐藻胶共孵育产生的寡糖进行了结构鉴定。结合标准品的保留时间和MS的判断结果(图7),鉴定了产品中的寡糖ΔM、ΔMG和ΔMM(图8A)。在Aly7Aq的降解过程中,降解初期产生了ΔM、ΔMG和ΔMM产物。随着酶用量的增加,寡糖不断积累,当酶用量为6.0U时,寡糖的降解率达到最大值。
03
结论
克隆、表达并鉴定了一种新的M特异性褐藻胶裂解酶Aly7Aq。Aly7Aq在50℃和pH10.0时表现出最高的活性。UPSEC-VWD-MS分析表明,Aly7Aq以随机内切方式降解多糖。终产物中Aly7Aq的寡糖主要为二糖至五糖,其中四糖含量最高。采用HPAEC-PAD/MS法对产品中的寡糖ΔM、ΔMG和ΔMM进行了鉴定。Aly7Aq的-1亚位点同时容纳M和G单位,而±2亚位点严格识别M单位。Aly7Aq的底物特异性来源于其−2和+2亚位点的特异性,这些亚位点仅容纳M残基。对Aly7Aq的研究将有助于明确褐藻胶裂解酶的作用模式、研究其专一性和可靠应用。新型M专一性褐藻胶裂解酶Aly7Aq具有明确的作用模式和明确的产物结构,为褐藻胶的研究和开发提供了一个定制的工具。
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.133972
END
前期回顾
《BIOTECHNOL BIOFUELS》来自船蛆内共生菌 P. megotara 的 GH5 纤维素酶家族的生化和结构特征