2024年1月，来自Kagoshima University的Kiyotaka Fujita等人在Applied Microbiology and Biotechnology上发表了一篇题为Bifidobacterial GH146 β-L-arabinofuranosidase for the removal of β 1,3-L-arabinofuranosides on plant glycans的研究性论文。

Pfam DUF1680（PF07944）已重命名为Glyco_hydro_127，包含24000 种蛋白质，分布在7482种细菌、真菌和植物物种中。HypBA1（Bll1HypBA1；由BLLJ_0211编码）是第一个表征的GH127 β-L-阿拉伯呋喃糖酶（EC 3.2.1.185）。来自长双歧杆菌长亚种JCM1217的Bll1HypBA1降解从Ara释放的Ara f-β1,2-Ara3-GH121 β-L-阿拉伯生物苷酶的Hyp（HypBA2：BLLJ_0212）。Bll1HypBA1的晶体学研究表明，半胱氨酸残基充当催化亲核试剂。除了用于 Bacteroides thetaiotaomicron 中RG-II降解的GH137和GH142 β-L-阿拉伯呋喃糖酶之外，在将BT0349表征为阿拉伯衍生的阿拉伯四糖和β1,2-L-阿拉伯二糖的 β-L-阿拉伯呋喃糖酶后建立了GH146。还表征了来自黄单胞菌（XeHypBA1）的GH146成员XCV2724。这种酶主要和部分水解Ara f-β1,2-Ara。除了两个GH127成员（Bll1HypBA1和BLLJ_1826）外，长双歧杆菌长亚种JCM 1217编码两个GH146成员（BLLJ_1848和BLLJ_0089）。BLLJ_0089最近被表征为富含Hyp的糖蛋白（HRGP）骨架上 Araf-β1 连接的Hyp的 β-l-阿拉伯呋喃糖苷酶（Bll4HypBA1）。目前，已经报道了GH146家族中只有一种酶（BT0349）的三维结构。在本研究中，使用天然和合成底物将重组BLLJ_1848表征为β-1,3特异性GH146 β-L-阿拉伯呋喃糖酶（Bll3HypBA1）。此外，还进行了 Bll3HypBA1的X射线晶体学。

1.Bll3HypBA1基因的序列特征

Bll3HypBA1(BLLJ _ 1848)含有一个GH146催化结构域，一个信号肽，两个层粘连蛋白_G_ 3(LamG)结构域，属于刀豆蛋白A样凝集素/葡聚糖酶超家族，三个细菌Ig样结构域和一个跨膜结构域(图2A)。此外，这些特征与其他细胞表面锚定长芽孢杆菌糖苷酶共有。Longum JCM 1217，如 β-L-阿拉伯糖苷酶 HypBA2 (BLLJ _ 0212)，GH43α-L-阿拉伯糖苷酶HypAA (BLLJ _ 0213)，BlArafA (BLLJ _ 1854)，BlArafB (BLLJ _ 1853) ,blArafC (BLLJ _ 1852)，BlArafD (BLLJ _ 1851)，BlArafE (BLLJ _ 1850)，gH43_24外显子-β-1,3-半乳糖酶 Bl1,3 Gal (BLLJ _ 1840)和 GH30 _ 5外显子-β-1,6-半乳糖生物水解酶 Bl1,6Gal (BLLJ _ 1841)。Bll3HypBA1催化结构域的aa序列与HRGP骨架上的Araf-β1连接的Hyp的另一 GH146旁系同源物Bll4HypBA1(β-L- 阿拉伯糖苷酶)表现出30%的同一性。此外，Bll3HypBA1与来自Bacteroides thetaiotaomicron的其他表征的 GH146 β-L-阿拉伯糖苷酶BT0349和来自X. euvesicatoria的XeHypBA1分别表现出31%和28%的同一性。此外，GH146和GH127酶在系统发生树中分离(图2B) ，Bll3HypBA1分别与 GH127β-L-阿拉伯糖苷酶旁系同源物Bll1HypBA1和Bll2HypBA1(BLLJ _ 1826)仅有23%和19%的相同性。GH127和GH146催化结构域的比对表明，Zn 配位残基和催化残基在Bll3HypBA1中是保守的。

图2. Bll3HypBA1和GH127/146 β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的序列特征。Bll3HypBA1的结构域。使用Signal P5.0和Inter Pro服务器。结构域如下:信号肽( SP ))预测结构域结构，层黏连蛋白G_3 ( LamG )，细菌Ig样结构域( Ig )和跨膜区( TM )。在这里，线表示Bll3HypBA1重组蛋白的表达区域。B多形拟杆菌VPI-5482、X . euvesicatoria和长双歧杆菌subsp. longum JCM 1217中GH146和GH127 β -L-阿拉伯呋喃糖苷酶成员的系统发育树。用MEGAX软件构建系统发育树。以前或本研究中表征的酶都封闭在盒子中。其中，星号( * )表示已进行晶体学研究的酶。除BT1003 (槭汁酸水解酶)外，几乎所有酶都被鉴定为β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。Gen Bank登录号为：Bll1HypBA1/BLLJ_0211 ( BAJ65881)，Bll2HypBA1/BLLJ_1826 (BAJ67491)，Bll4HypBA1/BLLJ_0089 (BAJ65759)，XeHypBA1/XCV2724 (CAJ24403 )，BT_0349 (AAO75456)，BT_2911 (AAO78017 )，BT_0137 (AAO75244)，BT3531 (AAO78637)，BT2097 (AAO77204)，BT1003 (AAO76110)，BT3674 (AAO78779)。

2.重组Bll3HypBA1蛋白的制备

不含N末端信号肽和C末端结构域的重组Bll3HypBA1-NΔ35CΔ761蛋白（图2A）在20℃诱导条件下仅以低表达水平检测为可溶性蛋白。纯化后的重组Bll3HypBA1-NΔ35CΔ761蛋白在SDS-PAGE上以单条带迁移，这与理论分子质量129,964 Da一致。为了获得适合X射线晶体学和生化分析的克隆，我们构建了不含LamG区的Bll3HypBA1-NΔ379CΔ761和Bll3HypBA1NΔ379CΔ933。这些克隆在30°C下表达为可溶性蛋白，纯化为单带，与Bll3HypBA1-NΔ379CΔ761的理论分子量94,145Da和ll3HypBA1-NΔ379CΔ933的理论分子量75,016Da一致。凝胶过滤色谱法估计Bll3HypBA1-NΔ379CΔ761和Bll3HypBA1-NΔ379CΔ933的分子质量分别为91 kDa和76 kDa，这表明这两种蛋白质结构在溶液中都是单体的（数据未显示）。

3.重组Bll3HypBA1蛋白的底物特异性和一般性质

以一些天然多糖为底物，比较了Bll3HypBA1与其它三种B. longum subsp. longum JCM 1217的底物特异性。如图3A所示，Bll3HypBA1-NΔ35CΔ761从阿拉伯甜菜多糖、落叶松AG和阿拉伯胶AGP中释放L-阿拉伯糖，而长链假单胞菌 JCM 1217中的其他旁系同源物则不能。这一结果表明Bll3HypBA1具有特异的降解这些多糖末端β-lAraf部分的能力。Bll3HypBA1一夜反应后的L-阿拉伯糖含量为：甜菜阿拉伯糖0.32%，落叶松AG 0.39%，阿拉伯胶AGP 0.20%。这一结果表明在AGP和阿拉伯人体内存在少量的末端β-l-Araf残基。Bll3HypBA1也从Araf-β1,3-ArafGal2中释放L-阿拉伯糖（图3B左）。降解的ArafGal2的质量为m/z 474.40 (calc. m/z 474.16)，与Araf-β1,3-ArafGal2的L-阿拉伯糖（MW 132） (m/z 606.48；calm /z 606.20)。随后，释放的ArafGal2被α-larabinofuranosidase BlArafA进一步水解为β1,6-Gal2。bl3hypba1也从Araf-β1,3- Araf4中释放L-阿拉伯糖(m/z 678.77；calc. m/z 678.22)，水解产物Araf4被黑曲霉α-L-阿拉伯糖醛酸苷酶AnAFASE进一步降解（图3B，右）。

图3. Bll3HypBA1的底物特异性。以阿拉伯甜菜多糖、落叶松AG和阿拉伯胶AGP为底物进行薄层色谱分析。底物在不存在(−)或存在(+)酶（Bll1HypBA1, Bll2HypBA1, Bll3HypBA1-NΔ35CΔ761，或Bll4HypBA1）的条件下于37℃孵育16小时。B HPAEC-PAD分析使用Araf-β1,3-Arafgal 2和Arafβ 1,3-Araf4作为底物。将底物与Bll3HypBA1-NΔ379CΔ761在40°C下孵育16 h。水解产物进一步与α-L阿拉伯糖醛酸苷酶BlArafA或AnAFASE孵育。在不含(−)或存在Bll3HypBA1NΔ379CΔ933或Bll1HypBA1的情况下，用Araf-β1,2-Araf-α-OMe (β2)、Araf-β1,3-Araf-α-OMe (β3)和Araf-β1,5-Araf-αOMe (β5)在37°C下进行16 h的C薄层色谱分析。a底物为(+)完全水解，(±)部分水解，(−)未水解。

Bll3HypBA1-NΔ379CΔ761对Araf-β1,3-ArafGal2的比活性比Arafaf -β1,3-Araf4的比活性高2倍（表2）。在落叶松AG、阿拉伯甜菜聚糖和阿拉伯胶AGP的比活性比较中，含有N端LamG的Bll3HypBA1-NΔ35CΔ761比不含N端LamG的Bll3HypBA1-NΔ379CΔ761的比活性分别高5.8倍、1.7倍和1.1倍。另外，Araf-β1,3- ArafGal2的Bll3HypBA1-NΔ35CΔ761比Bll3HypBA1-NΔ379CΔ761低1.6倍。

表2. Bll3HypBA1对末端含有β-Araf结构的寡糖的底物特异性

此外，还使用含有末端β1,2-、β1,3-和β1,5-Araf结构的合成阿拉伯糖双糖来详细评估该酶的连锁特异性。Bll3HypBA1从Araf-β1,3-Araf-α-OMe释放L-阿拉伯糖，从Araf-β1,2-Araf-α-OMe释放少量，但不从Araf-β1,5-Araf-α-OMe释放L-阿拉伯糖（图3C）。相反，Bll1HypBA1完全水解了这些底物。与含有Araf-β1,3-连锁的Araf-β1,3-Arafgal2相比，Bll3HypBA1对Araf-β-pNP、Araf-β-OMe、Araf-β-Hyp糖苷和含有Araf-β1,3-连锁的β-AOS具有<1%的降解活性（表2）。这些结果表明，Bll3HypBA1是一种针对Araf-β1,3-Araf结构的β-L-阿拉伯糖苷酶。Araf-β1,3-ArafGal2-ABEE的最佳温度和pH分别为50℃和5.5℃。以5%甲醇、乙醇和1-丙醇为受体，通过TLC检测转糖基化产物。这些TLC斑点的Rf值与先前的Bll1HypBA1相似。这一结果表明Bll3HypBA1与其他GH127/146酶具有相同的异构体保留酶活性。

水稻花药AGP预测含有Araf-β 1,3-ArafGal2侧链，如图4右列示意图所示。为了明确Bll3HypBA1在AGPs降解中的重要性，我们与AGP降解酶进行了组合反应。单独的Bll3Hyp BA1反应产生少量的l -阿拉伯糖，而不含Bll3Hyp BA1的Bl1,3Gal和BlAraf A反应除了产生l -阿拉伯糖、半乳糖和β 1,6-Gal2外，还产生Araf - β 1,3-Araf Gal2 (图4 )。相反，Araf - β 1,3-ArafGal2在三种酶参与的联合反应中完全降解为l -阿拉伯糖和β 1,6-Gal2。长双歧杆菌subsp. longum JCM 1217中释放的β 1,6-Gal2可能被胞内的GH42 β-半乳糖苷酶( BLLJ _ 0443 )降解为半乳糖。这些发现表明Bll3HypBA1是一种有效的降解AGPs的细胞表面锚定酶。

图4. 双歧杆菌AGP降解酶对水稻AGP的逐步水解。用Bl1,3Gal，BlArafA和Bll3HypBA1-NΔ35CΔ761组合培养水稻AGP。原理图显示在右栏中。酶的切割位点：Bl1,3Gal（黑色箭头），BlArafA（灰色箭头），Bll3HypBA1（白色箭头）。

4.Bll3HypBA1的晶体结构

Bll3Hyp BA1-NΔ379CΔ761 ( aa : 380 ~ 1223)的晶体结构通过SeMet衍生物的单波长反常色散确定，分辨率为1.75 Å。NΔ379CΔ761结构中每个不对称单元含有1个分子，残基M379-V1051建模。在NΔ379CΔ761结构的活性位点中，可以清楚地观察到由E723，C725，C804和C805配位的Zn原子，并且有一个Tris分子与L-阿拉伯糖结合位点(亚位点 - 1)结合。进行了晶体学反常散射分析以识别金属原子。在1.280 Å波长下采集的数据的Bijvoet差异密度图显示在金属位点处有一个突出的峰，而在1.300 Å波长下采集的数据的差异图显示在Zn的吸收边( 1.2837Å )上方，异常散射能力显著降低。这一结果证实了活性位点结合的金属离子为Zn2+。

由于NΔ379CΔ761结构中1052位残基后面的区域是无序的，我们也结晶了Bll3Hyp BA1-NΔ379CΔ933 ( aa : 380 ~ 1051)结构。NΔ379CΔ933的晶体结构测定分辨率为1.70 Å (表S3 )。N Δ 379C Δ 933结构中每个不对称单元包含两个分子，从M379到E1050的残基被模拟为两条链( A、B)。三个分子，包括NΔ379CΔ761中的一个和NΔ379CΔ933中的两个，具有几乎相同的主链结构，所有链对之间的C α原子的均方根偏差( RMSD )值小于0.24 Å。NΔ379CΔ933的锌配位位点结构也与N Δ 379CΔ761几乎完全一致，但在活性位点没有鉴定到Tris分子。因此，我们重点研究了NΔ379CΔ933的A链结构。

GH146Bll3Hyp BA1的晶体结构由3个结构域组成：催化( α/α ) 6桶( aa : 379 ~ 820)、β -三明治1 ( aa : 821 ~ 920)和β -三明治2 ( aa : 921 ~ 1051) (图5A )。GH146家族成员BT0349具有α -螺旋连接子和紧随β -三明治2结构域之后的果冻卷曲结构域(图5B )。尽管BT0349的C -末端果冻卷曲结构域在结构上与碳水化合物结合模块( CBM )家族35相似，但该结构域的功能仍然未知。而GH146酶( Bll3HypBA1和BT0349)在溶液中为单体，GH127Bll1Hyp BA1通过β-三明治2结构域之间的相互作用形成同源二聚体(图5C )。GH146酶( Bll3Hyp BA1含有2个β -折叠的loop , BT0349含有果冻卷曲结构域)的β-三明治2结构域中的扩展结构元件与催化结构域(图5A和B)相互作用。

图5 GH146和GH127酶的整体和催化结构域结构。A GH146 Bll3HypBA1和B GH146 BT0349的A - C结构域结构和C GH127 Bll1HypBA1的二聚体结构。显示了彩虹色（从N到c端由蓝到红）的带状表示。红色圆圈表示活性部位的Zn原子（灰色球体）。D-F D GH146 Bll3HypBA1、E GH146 BT0349和F GH127 Bll1HypBA1催化结构域的俯视图。在E中，α-螺旋连接子和C端果冻卷结构域显示为透明色（橙色到红色）。

图5D，E和F描绘了GH146和GH127酶的催化结构域的俯视图。在Bll3HypBA1中，β-三明治2 ( aa : 947 ~ 969)的loop 1部分覆盖了活性位点，而loop 2 ( aa : 707 ~ 718)则支持loop 1 (图5D )。BT0349的C端果冻卷曲结构域屏蔽了其活性位点(图5E ,透明红色)。第1环( aa : 566 ~ 590)远离BT0349的活性位点，第2环缺失。在GH127Bll1Hyp BA1中，活性位点被( α/α ) 6桶状结构域中的长环A ( aa : 35 ~ 49)覆盖(图5F )。

图6描绘了GH146和GH127酶的活性位点结构。Zn原子与Bll3HypBA1中的E723，C725，C804和C805配位(图6A )。Bll3Hyp BA1的锌配位结构与BT0349和Bll1Hyp BA1 (图6B和C)相同。R273、H194、H142和Y145构成GH127Bll1Hyp BA1的底物结合位点(图6C )，而这些残基在GH146酶中完全不同。F448和I522在Bll3Hyp BA1中占据活性位点(图6A )，而W162在BT0349中占据该位置(图6B )。因此，这些残基可能决定了Bll3Hyp BA1的β-连接特异性。

图6. GH146和GH127酶的活性位点结构。A GH146 Bll3HypBA1, B GH146 BT0349, C GH127 Bll1HypBA1。锌配位残基的标记特征被加了下划线。催化残基（亲核试剂和酸碱催化剂）用红色字符标记。

5.突变分析

接下来，利用定点突变，确定了活性位点残基对酶活性的显著性(图7 )。在Zn配位残基( E723、C725、C804、C805)，催化残基( E694和C804)和靠近催化中心( W429、Y526、E578、H628、N630、T631、Y771)的残基处进行了取代。以Araf-β 1,3-Araf-α-OMe为底物，通过TLC分析突变体的活性。Zn配位和催化残基( E694Q、E694A、E723Q、E723A、C725S、C725A、C804S、C805S、C805A)处的突变酶完全失去活性(图7A )。HPLC分析也证实了这些残留物的重要性。对于其他活性位点残基，E578A也失去了活性，而W429A、Y526A和N630A在TLC上显示出轻微的L -阿拉伯糖释放斑点，表明活性显著降低(图7A )。H628A、T631A和Y771A在37 ° C反应30 min后，底物Araf-β 1,3-Araf -α-OMe有残余斑点，而底物l -阿拉伯糖有明显斑点，表明这些突变体保留了其活性。

图7. Bll3HypBA1基因突变分析。使用Araf-β 1,3-Araf-α-OMe在37 °C下对野生型Bll3HypBA1-NΔ379CΔ933及其突变体进行30   min的TLC分析。B受突变影响显色的活性位点残基：品红色，突变体未检测到活性；绿色，TLC检测活性弱；蓝色，活性检测；白色，不检验。

突变分析的结果用彩色编码显示在图7B中。突变酶中无活性的残基、有轻微活性的残基和有显著活性的残基分别用洋红色、绿色和蓝色表示。Zn配位的3个Cys和1个Glu残基以及酸/碱催化剂残基对活性至关重要。在活性位点上，E578突变体缺乏活性。W429和E578可能在 - 1亚位点参与底物识别(图6A )。N630和Y526在活性中也起着重要的作用。H628、T631和Y771参与底物识别但不是活性所需。这些非必需残基可能在亚位点 + ①识别Araf-β 1,3-Araf的还原末端。

Bll3HypBA1含有2个独立的LamG结构域模块。通过比较Bll3HypBA1-NΔ35CΔ 761和Bll3HypBA1-NΔ379CΔ761与N-末端LamG的反应性，前者对多糖的反应活性高于后者。值得注意的是，N端LamG结构域在B. longum subsp. Longum JCM 1217中相邻的2个AGP降解酶( Bl1 , 3Gal和Bl1 , 6Gal)和4个GH43 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶( Bl Araf B-E )中保守。双歧杆菌中的CBMs被预测为底物和/或水解产物的对接位点。N端LamG结构域可能有助于双歧杆菌细胞表面锚定酶对AGPs和阿拉伯多糖的降解。

在本研究中，Bll3Hyp BA1的晶体结构被确定为GH146成员继BT0349之后的第二个三维结构。BT0349具有覆盖活性位点的C-末端果冻卷曲结构域，该酶似乎不结合聚合物底物(图5B)。BT0349存在于鼠李半乳糖醛酸聚糖-I ( RG-I )的PUL中，由多个GH组成，预期作用于其他GH切割的寡糖。相反，Bll3Hyp BA1可以独立作用于水稻AGP (图4)。这与Bll3HypBA1的结构特点是一致的，它不含有覆盖活性位点的大的结构元件。Bll3HypBA1的Zn原子与Cys3-Glu残基配位，GH127和GH146酶共享这一结构特征。在之前的研究中，利用针对半胱氨酸糖苷酶设计的合成抑制剂阐明了GH127Bll1HypBA1的反应机理。已经证明，半胱氨酸与Zn2+的配位对于硫代糖基中间体的脱糖基化是必需的，这在没有金属配位的情况下在能量上是不利的。因此，这种锌配位结构是GH-P ( GH127和GH146)家族所共有的，半胱氨酸作为催化亲核残基。此外，对Bll3HypBA1的活性位点残基进行了突变分析，并证明了这些残基对酶活性对β 1,3-连接的Araf二糖的重要性。除了Zn配位和催化残基外，E578被证明是活性所必需的。其他几个活性位点残基已被证明对酶活性有显著贡献，为Araf-β 1,3-连接的严格识别提供了结构基础。

虽然已知来自塞内加尔相思的阿拉伯胶AGP在Araf -α 1,3-末端糖处被Gal-α 1,3-或Arap-β 1,3-部分取代，但Arap-β 1,3-取代的存在从未被报道过。双歧杆菌GH39的3-O-α-D-半乳糖基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶已被鉴定用于释放Gal-α 1,3-Araf二糖和3-O-β-L-阿拉伯吡喃糖基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶用于释放AGP上的Arap-β 1,3-Araf二糖。阿拉伯胶AGP和落叶松AG中已证实存在β-Araf，但连接位置尚不清楚。除了藜麦阿拉伯多糖和水稻AGP，我们在落叶松AG、阿拉伯胶AGP和甜菜阿拉伯多糖中发现了Araf-β 1,3替换。这些结果表明AGPs和阿拉伯多糖可能含有Araf-β 1,3-末端连接。由于部分取代糖阻止了细菌对这些多糖的酶降解，因此Bll3HypBA1和直系同源酶的存在有利于一些具有AGP降解能力的双歧杆菌和拟杆菌物种。Jones等从瘤胃真菌中发现了GH39 α-L-(β-1,2)-阿拉伯呋喃糖苷酶；该酶在甜菜阿拉伯多糖上释放Araf-β 1,2-Araf二糖。据我们所知，目前尚未发现Araf-β 1,3-Araf二糖释放酶。由于Araf-β 1,3-Araf结构的特异性，Bll3HypBA1可用于多糖结构分析、寡糖制备和Araf-β 1,3含量测定。

DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-024-13014-8