2021年12月，Sheng Wang等人在《Journal of Cleaner Production》上发表了一篇题为Preparation of methyl-esterified pectin oligosaccharides with antibacterial activity using fungus-derived bifunctional pectinase的研究性论文

2. 双功能S6A中S6PE和S6PG之间的分子内协同作用

^a为以柑橘果胶（55-70%DM）和PGA为底物，分别测定果胶甲基酯酶活性和多聚半乳糖醛酸酶活性。

对由相同摩尔量的酶（4.5 nM）组合水解的果胶释放的POS进行时间过程分析的结果显示，与S6PE+S6PG相比，S6A-PEQ178A+S6PE的GalA2（3590±5μM）、GalA3（1140±18μM）和GalA4（407±4μM）的产量显著降低（图2C-E，GalA2，3970±4μM；GalA3，1380±13μM；GaA4，666±1μM）。S6PE结构域的活性是果胶水解的限速步骤，S6A-PE-Q178A中失活的S6PE结构区对S6PG起着负面作用，果胶水解活性降低；因此POS的产量显著降低。与S6PE+S6PG相比，C末端S6PG失活突变体S6A-PG-D611A+S6PG显著影响果胶水解。特别是，S6A-PG-D611A+S6PG和S6PE+S6PG产生的GalA3和GalA4分别在约190和120分钟以及310和220分钟达到最大产量（图2D和E）。我们怀疑S6A-PG-D611A中失活的S6PG结构域是分子内协同作用的，有助于识别S6PE结构域和与底物结合的效率，从而提高催化效率。时间过程研究结果表明，S6A-PE-Q178A+S6A-PG-D611A释放GalA、GalA2和GalA3，与双功能S6A释放的类似，但GalA4产量增加了23.1%（820±3 vs 666±1μM）。结果表明，在双功能S6A中，分子内协同效应比负协同效应更为明显。

为了保证水解产物的特异性，提供了双功能S6A中S6PE和S6PG两个催化结构域介导的果胶多糖协同水解的示意图（图3）。双功能S6A中的S6PE和S6PG结构域同时与果胶多糖结合并发挥水解作用。S6PG结构域的失活突变体S6A-PG-D611A提高了S6PE在S6A-PG-D611A中的水解效率，S6PE结构域的灭活突变体S6A-CE-Q178A抑制了S6PG介导的正常水解。然而，当双功能S6A水解果胶时，S6PE和S6PG的催化效率显著提高，这是由于分子内协同作用的增加，而不是与S6A的负协同作用。

分别使用柠檬酸从柑橘皮和苹果渣中提取柑橘果胶（0.85克）和苹果渣果胶（0.68克），产率分别为17.0%和19.4%。提取率高于柑橘皮（16%）和苹果渣果胶（16.9%），这可能是由于提取过程中残留的固体杂质和清洗不彻底造成的。在柑橘皮和苹果粉的表面观察到松散和多孔，并出现许多无序的皱纹，但从中提取的粗果胶中发现了许多微裂纹和细长孔的粗糙表面。以柑橘皮和苹果渣中的果胶为底物，双功能S6A和S6PE+S6PG产生的还原糖总量相当（柑橘皮果胶7415±68μM vs 7246±92μM，苹果渣果胶7640±99μM vs 7565±85μM），表明双功能S6A可以最佳水解粗果胶多糖。研究结果进一步证实了这些水果加工副产品作为可再生果胶来源的潜在用途。

4. 双功能S6A衍生POS的抗菌作用

POS具有多种性能，在食品、化妆品、医药、饲料等行业具有广阔的应用前景。例如，POS可以显著减少脂多糖引发的炎症反应，促进人体肠道中几种有益细菌的生长。猕猴桃果肉中的POS具有益生元和抗糖基化特性。此外，POS是具有竞争力的天然抗菌剂，对食品腐败微生物具有强大的抗菌活性。因此，我们评估了双功能S6A产生的POS的抗菌作用。如图4所示，柑橘皮和苹果渣中的POS对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有明显的抗菌活性。对于柑橘皮中的POS，抗菌活性在30分钟内随着反应时间的延长而增加，在双功能S6A介导的水解30分钟时出现最大直径的抑制区（图4A和C），革兰氏阳性菌对黄体金黄色葡萄球菌的值为42.3 mm，金黄色葡萄杆菌的值为18.4 mm，革兰氏阴性菌对鼠伤寒沙门氏菌的值为19.1 mm，对大肠杆菌的直径为14.3 mm。此后，抑制区减少；原因可能是相对较长的POS降解为单糖，没有抗菌活性或抗菌活性低。与柑橘皮中的POS一致，双功能S6A产生的苹果渣中的POS在双功能S6A介导的水解30分钟时表现出最大的抗菌活性（图4B和C），对革兰氏阳性菌的最大抑菌区直径为黄体金黄色葡萄球菌40.1 mm和金黄色葡萄菌17.9 mm，对革兰氏阴性菌的最大抗菌区直径为鼠伤寒沙门氏菌17.2 mm和大肠杆菌12.5 mm。本研究结果与其他研究结果一致，表明芒果皮中的POS对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（21.1 mm）、革兰氏阴性鼠伤寒沙门氏菌（18.0 mm）和大肠杆菌（18.2 mm）具有抗菌活性。

图4. 双功能S6A产生的果胶寡糖（POS）对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抗菌活性。柑橘皮（A）和苹果渣（B）中的POS对金黄色葡萄球菌、黄体葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的抗菌活性。（C）POS对四种细菌的最大抑菌圈直径。I、无菌生理盐水；II、低聚半乳糖醛酸标准品（GalA、GalA2、GalA3和GalA4；2mg/mL）；III、苹果渣POS；IV、柑橘皮POS。不同浓度柑橘皮（D）和苹果渣（E）中的POS对四种细菌的抗菌作用。

如图4D和E所示，测定了双功能S6A在30分钟内对水解产物的细菌敏感性。柑橘皮和苹果渣中的POS均显示出抗菌活性，且呈浓度依赖性增加（0.1-2.0 mg/mL）。在四种细菌中，革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和M.luteus对双功能S6A衍生的POS最敏感，柑橘皮和苹果渣的POS MIC值分别为~0.5mg/mL。革兰阴性鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的MIC值相对较高，柑橘皮和苹果渣中的POS值分别为0.6 mg/mL和0.8 mg/mL。与抗生素耐药性不同，抗生素耐药性通常在革兰氏阴性菌中比在革兰氏阳性菌中更普遍，由于其膜结构，POS对革兰氏阳性菌的杀菌作用比对革兰氏阴性菌更强。吴等人报道，POS的抗菌活性可归因于膜的渗透性、适当的分子量和酯化度。

5. 双功能S6A衍生POS的分子分布

由于双功能S6A从柑橘皮和苹果渣中产生的POS的最大抗菌活性都发生在30分钟的反应时间，因此使用UHPLC-HRMS在负离子模式下分析了某一时间点释放的POS的结构。如多蒙和科斯特洛所述，对碎片进行了分析。值得注意的是，在两个反应体系的最终产物中检测到相同的碎裂离子，分别校准为GalA、GalA2、GalA3、GalA4、GalA3（OMe）和GalA4（OMe。这些结果表明，双功能S6A具有很高的水解特异性。在双功能S6A介导的最终水解产物中，除了GalA3（OMe）和GalA4（OMe）外，特征性裂解离子C1、C2、C3和C4被鉴定为GalA、GalA2、GalA3和GalA4，用于从柑橘皮和苹果渣中提取果胶（图5A-D，图6A-D）。为了进一步确定甲酯基在GalA3（OMe）和GalA4中的位置，进一步分析了裂解模式。如图5E和6E所示，除了C3+1Me（m/z，559.11）外，还检测到Z2（m/z：351.05）、C2（m/z；369.06）和其他碎裂离子。裂解离子Z2和C2表明GalA3（OMe）中的甲酯修饰位于整个糖链的末端，即GalA-GalA-GalA（OMe。裂解离子C3进一步表明，GalA4（OMe）中的甲酯修饰也位于整个糖链的末端，即GalA-GalA-GalA-GalA-GalA（OMe，见图5F和6F）。此外，在来自柑橘皮的POS中检测到GalA5、GalA5（OMe）、GalA6（OMe）₂、GalA6（OMe）₄和GalA7（OMe）₂（图5G），并且在来自苹果渣的POS中检测到GalA5、GalA6（OMe）₂和GalA7（OMe）₂（图6G）。各种水解果胶的果胶酶产生具有不同聚合度和侧链修饰的POS。例如，Acinetobacter guillouiae菌株TD1、Kosakonia sacchari菌株TD2和Bacillus vallismortis菌株PD1可以将果胶完全降解为GalA、GalA2和GalA3。甜菜浆被果胶酶混合物水解，主要产生阿拉伯糖、部分乙酰化的鼠李糖醛酸和部分乙酰化/甲基酯化的高半乳糖醛酸寡糖，聚合度为3至7。果胶裂解酶水解苹果渣果胶，产生聚合度为4至6的不饱和POS。总之，我们的结果表明，无菌生理盐水和寡糖标准品（GalA、GalA2、GalA3和GalA4；2 mg/mL）没有抑制这四种细菌（图4C）。因此，观察到的抗菌性能应该是具有侧链修饰的POS。我们的研究结果进一步表明，经甲酯改性的POS具有抗菌作用。POS侧链上的甲酯基团在抗菌活性中起着重要作用。在药物分子中，用甲基取代氢原子可以显著增强抗菌活性。甲基取代对生物活性和生物活性分子的选择性具有有益的影响。然而，甲酯修饰的POS的抗菌机制需要进一步研究。双功能S6A的独特酶性能因其在食品、化妆品、制药和医药等行业的抗菌活性需求而闻名。

图5. 双功能S6A从柑橘皮中释放果胶寡糖（POS）的质谱。

图6. 双功能S6A从苹果渣中释放果胶寡糖（POS）的质谱。

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结论

DOI: https://doi.org/10.1016/j.jclepro.2021.130110