文献解读｜FSH糖型异质性对生殖功能的影响及其带来的临床应用展望

促卵泡激素（FSH）是一种由垂体前叶分泌的促性腺激素，由α亚基和β亚基组成的异二聚体糖蛋白，其对女性生殖至关重要。所有糖蛋白激素的α亚基相同，而β亚基决定促性腺激素的生物学特异性[1]。FSH蛋白分子共有四个N-链接的糖基化位点，分别分布在α亚基（包含2个糖基化位点：Asn⁵²和Asn⁷⁸）和β亚基（包含2个糖基化位点：Asn⁷和Asn²⁴）的氨基酸链上。α亚基的糖基化位点均被聚糖占据，而β亚基上的糖基化位点Asn⁷和Asn²⁴可能被聚糖占据，也可能不被聚糖占据。根据β亚基的糖基化位点占据情况，即修饰程度不同，FSH 具有四种糖型：完全糖基化的FSH²⁴，低糖基化的FSH¹⁸（缺失Asn⁷聚糖）、FSH²¹（缺失Asn²⁴聚糖）和 FSH¹⁵（缺失Asn⁷聚糖和Asn²⁴聚糖）这四种异构体[2]。随着年龄的增长，低糖基化的FSH²¹和FSH¹⁸分泌逐渐减少，因而，绝经后女性分泌的FSH中FSH²⁴占比增加[1]。

2023 年在Development发表的一篇题为"Oocyte quality is enhanced by hypoglycosylated FSH through increased cell-to-cell interaction during mouse follicle development"的研究，基于一种体外小鼠卵泡生长系统来评估FSH²¹和FSH²⁴对卵泡生长和卵母细胞质量的直接影响[1]。

该研究旨在评估为期 12 天的培养过程中不同浓度（1~100 ng/ml）FSH²¹和FSH²⁴对卵泡生长和存活的直接影响。结果发现：FSH²¹通过在卵泡生长早期增加细胞间的信号传导，促进卵泡生长，并改善了卵母细胞质量，而随着生殖衰老，体内 FSH²¹ 向 FSH²⁴的丰度转变可能导致卵母细胞质量的年龄依赖性下降。

相较于FSH²⁴，FSH²¹增强了次级卵泡的存活和生长

为了确定FSH糖型对卵泡存活和生长的影响，分别在含有两种不同浓度（1和10 ng/ml）FSH 糖型的培养基以及不含 FSH 的培养基（对照）中培养早期次级卵泡。培养到第 12 天时，除 1 ng/mL FSH²⁴组（存活率：43 ± 34.45%）和对照组（存活率：0%）外，所有糖型培养组的存活率均保持在 70% 以上。

与相同浓度的FSH²⁴相比，经10 ng/mL FSH²¹培养的卵泡在第 6 天、第 8 天和第 12 天的直径分别增加了 1.56 倍、1.28 倍和 1.18 倍。

图1. 从D0培养D6，D8和D12的卵泡生长情况[2]。

*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001

与FSH²⁴相比，FSH²¹介导了更多的卵泡雌二醇分泌

与其他培养组相比，10 ng/mL FSH²¹培养组观察到雌二醇分泌增加（第8 ~ 12天）；其中在第 8 天和第 12 天，FSH21培养组的雌二醇水平分别比 FSH²⁴培养组高出 13.4 倍和 4.5 倍。

FSH²¹提升了卵子质量

为确定FSH²¹介导的卵泡生长和雌二醇生成的增加是否可转化为卵子质量的改善, 研究者评估了体外培养的卵泡中, 卵母细胞在体外排卵信号刺激下产生 MII 卵子的能力（由于1 ng/mL FSH²⁴培养组的卵泡生长和存活率较差，研究者仅评估了在 10 ng/mL FSH²¹和 FSH²⁴条件下培养的卵泡）。结果发现，与经FSH²⁴培养的卵泡相比，FSH²¹培养组的卵泡中有更高比例的MII卵子表现出正常的MII纺锤体结构（76.32% vs 50%）。

两种 FSH 糖型都支持生成具备减数分裂能力配子的卵泡，但经FSH²⁴培养的卵泡更易产生染色体和纺锤体缺陷的卵子，从而影响卵子质量和发育潜力。

FSH²¹在不依赖于卵泡生长的情况下增加了细胞间的缝隙连接

跨区投射（TZPs）是由颗粒细胞（GC）产生的胞质投射，通过由连接蛋白37（由 Gja4 编码）组成的缝隙连接建立卵母细胞与GC之间的信号转导。此外，连接蛋白43（由Gja1编码）在卵泡GC之间建立缝隙连接。TZP数量和连接蛋白表达与卵母细胞和卵泡大小呈正相关，FSH是已知的小鼠卵泡中连接蛋白表达和 TZPs 调节因子。因此，研究者推测不同FSH糖型在卵泡建立TZPs 和缝隙连接的能力上会有不同的影响，而这可能带来卵泡生长和卵母细胞质量的差异。为此，早期次级卵泡分别经1或10 ng/mL的FSH糖型培养24小时，然后进行肌动蛋白染色（大多数 TZPs基于肌动蛋白）。

在透明带区域，10 ng/mLFSH²¹培养组的卵泡肌动蛋白染色显著高于所有其他培养组，相比相同浓度的FSH²⁴培养组增加了1.6 倍。这些数据表明FSH²¹刺激了早期卵母细胞-GC和GC-GC之间的连接，这种连接在卵泡生长之前发生，但可能由于增强的细胞间信号传导赋予了卵泡在后续生长上的优势。

FSH²¹通过缝隙连接介导机制促进GC之间的信号传导，从而增强卵泡生长和卵母细胞发育

为了确定卵泡内细胞之间的增强互动是否促进了卵泡生长，研究者对经 10 ng/mL FSH²¹和10 ng/mL FSH²⁴培养24小时后的卵泡GC进行了5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）染色，以作为细胞增殖的早期指标。与对照组相比，卵泡经 FSH²¹和 FSH²⁴培养后，EdU标记的GCs数量分别增加了2.4倍和1.6倍（前者比后者高出1.5倍）。

鉴于相比 10 ng/mL FSH²⁴培养组，10 ng/mL FSH²¹培养组可增加TZPs、GC特异性缝隙连接及GC增殖水平，研究者进一步探讨了细胞间信号转导是否直接调节 FSH²¹的增殖能力。用10 ng/mL FSH²¹与广谱缝隙连接抑制剂卡贝诺洛酮 (CBX) 共同培养卵泡后，FSH²¹促进GC增殖的作用消失，EdU标记水平与对照组相似。单独使用抑制剂的培养组与对照组相比，EdU标记的GCs比例没有显著差异。这表明FSH²¹通过缝隙连接依赖机制介导了GC的增殖。

为确定FSH²¹在24小时内诱导的缝隙连接依赖的早期增殖是否影响了长期的卵泡生长轨迹和卵母细胞发育结果，研究者进行了FSH²¹与CBX共同培养的24小时实验；之后，卵泡在剩余的长期培养期间仅用FSH²¹进行培养。值得注意的是，短期CBX培养并未影响卵泡的存活率（第10天的存活率为92 ± 6.9%，而FSH²¹对照组为95 ± 6.6%），表明短期CBX培养对卵泡无毒性。培养第10天时，FSH²¹与短期CBX共同培养组的卵泡显著小于FSH²¹单独培养组的卵泡（从105.2 ± 9.6 um增长到182 ± 35.6 um vs 从106.3 ± 8.6 um增长到205.1 ± 37.2 um）。培养第9天时，在经CBX短期培养的卵泡培养基中，雌二醇水平也降低。最后，CBX短期培养导致出现纺锤体和/或染色体排列异常的MII卵子比例增加。这些发现表明，FSH²¹对卵泡生成和卵母细胞发育的积极影响依赖于细胞间信号传导的早期建立。

上述动物研究表明，与完全糖基化的FSH²⁴相比，低糖基化的FSH²¹在促进卵泡生成和改善卵子质量方面更为有效。在机制上, FSH²¹通过早期建立缝隙连接来介导细胞间的相互作用，增强了GC的增殖、卵泡生长及功能。相应地，卵子质量也有所提高，表现为更高比例的成熟卵子（具有正常的减数分裂纺锤体和染色体排列）（图2）。

图2. 不同 FSH 糖型对体外卵泡生成和卵母细胞质量的影响示意图[1]。

FSH²¹通过增加卵母细胞与颗粒细胞之间的TZPs以及颗粒细胞之间的缝隙连接来促进早期细胞间信号转导。诱导颗粒细胞增殖增加、卵泡生长、雌二醇分泌增加，相比FSH²⁴显著改善了 MII 卵子质量。

上述动物研究数据提示，增加FSH²¹在FSH制剂中的比例可能是提高卵泡和卵母细胞发育效果的一个潜在途径。那么现有医学辅助生殖领域中使用的FSH制剂现状如何呢？

2023年发表在Int J Mol Sci的一篇题为“Follicle-Stimulating Hormone Biological Products: Does Potency Predict Clinical Efficacy?”的综述阐述了FSH糖基化异质性如何影响FSH制剂的生物学活性，并分析了不同FSH制剂在人体内的药代动力学/药效学（PK/PD）和临床应答。

FSH是一种复杂的分子，其宏观和微观异质性带来不同糖型FSH，影响了靶细胞水平的生物效应以及血浆半衰期和清除率[2]。

FSH的糖基化修饰宏观异质性是指在β亚基上潜在的糖基化位点存在未被糖基化的现象，这种复杂的寡糖侧链不均一性会影响FSH的代谢清除率和生物活性[3]。相比完全糖基化的FSH，低糖基化的FSH具有更高的受体亲和力、体外生物学活性，同时肾脏清除率增强，半衰期也更短[2,3]。

FSH的微观异质性是指α和β亚基上N-聚糖结构的多样性，这种复杂的多样性可能会影响其体内生物学功能和清除速率。FSH的N-聚糖主要是复合型聚糖，一般具有2个、3个或4个糖基化分支 (又称为天线) [3]。有研究表明，分支末端的触角会影响FSH与其受体的结合: 体积大和延伸的聚糖可能导致受体反应延迟，而相对体积小而紧凑的聚糖具有更快速的受体结合能力[3]。唾液酸基团位于N-糖链的末端，可以通过α 2,3或α 2,6连接附着在半乳糖上; 不同糖基化分支的末端唾液酸化程度存在差异, 这种修饰程度按照修饰数量可以分为中性唾液酸化、单唾液酸化、二唾液酸化、三唾液酸化和四唾液酸化糖型。在FSH异构体中，含较少唾液酸的异构体具有较短的血浆半衰期和较高的清除率[4]，表现出更高的 FSH 受体（FSHR）结合亲和力[2]。

图3. FSH糖基化微观异质性与生物功能的关系[2,3]

当前辅助生殖技术（ART）治疗中使用的hFSH制剂种类较多，包括尿促性腺激素（u-hFSH和hMG）、r-hFSH α及其生物类似药、r-hFSH β和r-hFSH δ等。

尿促性腺激素主要由完全糖基化的（hFSH²⁴）糖型组成，高度唾液酸化（包含 α 2,3-和α 2,6-唾液酸糖链）和高度糖基化，具有较长半衰期，但FSHR结合亲和力较低。原研 r-hFSH α含约5%的不含唾液酸的中性FSH糖型，25%的单唾液酸化 FSH糖型，50%的双唾液酸化FSH糖型，15%的三唾液酸化FSH糖型，以及<5%的四唾液酸化FSH糖型。相比尿促性腺激素，r-hFSH α具有较短的血浆半衰期和更高的FSHR结合亲和力, 其在糖基化谱和聚糖种类分布方面具有高批次一致性[2]。r-hFSH β 的糖基化谱与r-hFSH α非常相似；但现有的已发表证据并未提供r-hFSH β的质量与生物活性之间的换算因子。r-hFSH δ包含α 2,3和α 2,6唾液酸糖链，唾液酸化程度接近绝经期尿FSH，三支聚糖和四支聚糖比例高，相比r-hFSH α，其肾脏清除率较低，血清清除速度较慢。

临床疗效方面，相比r-h FSH α和r-hFSH β，相同IU剂量的尿促性腺激素产生的卵子数更少[2]。Meta分析和随机对照试验显示，在相同启动剂量下，接受原研r-hFSH α治疗组的活产率高于生物类似药组。r-hFSH δ则尚未建立一种可靠的方法来比较其与其他hFSH制剂的临床疗效，基于r-hFSH δ个体化起始剂量和r-hFSH α或其他促卵泡激素固定起始剂量间的比较，无法得出等效性[2]。

根据β亚基糖基化修饰程度的不同，FSH分为FSH²⁴、FSH²¹、FSH¹⁸和FSH¹⁵ 四种糖型。其中低糖基化的FSH¹⁸/FSH²¹会随着年龄的增长会减少，绝经后女性分泌的FSH中FSH²⁴占比增加。动物研究提示，相较FSH²⁴，FSH²¹在促进卵泡生长、雌二醇分泌以及通过增加卵泡形成早期细胞间的信号传导来促进卵泡形成和改善卵母细胞质量方面具有优势。目前临床上应用的FSH制剂包括尿促性腺激素、r-h FSH α及其生物类似药、r-h FSH β和r-h FSH δ等，其中原研r-h FSH α在糖基化谱和聚糖种类分布方面具有高批次一致性[2]，其较尿促性腺激素含有更高FSH²¹异构体[6]，这带来了更强的FSH受体亲和力[2]和更高的生物效能[7]。

参考文献