徐卫/梁金花教授团队探索基因分型时代DLBCL中MYC/BCL2双表达真正的预后意义

研究纳入246例在2021年12月至2023年9月诊断的DLBCL患者（JSPH队列），并在外部队列中纳入了来自3项已发表研究的930例DLBCL患者。

外部队列根据LymphGen进行基因分型，双表达DLBCL （DEL）占比30.2%，主要分布在OTHER亚型（42.0%）、EZB亚型（28.3%）和MCD亚型（15.0%），其中MCD亚型的DEL比例最高。在DLBCL中，DEL对总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）均有不良影响。根据MYC/BCL2蛋白表达情况将非DEL患者分为双阴性（DN）、MYC单阳性和BCL2单阳性：DEL患者的OS和PFS均较DN和BCL2单阳性患者更差，而DEL患者与MYC单阳性DLBCL患者的生存期无显著差异；可见MYC表达的不良影响超过BCL2的表达。在不同的基因亚型中，与非DEL相比，DEL仅在EZB和OTHER亚型中对OS有显著不利影响，DEL仅在OTHER亚型中对PFS有负面影响。在排除OTHER或EZB基因亚型患者后，DEL和非DEL患者的生存率无显著差异。

在JSPH队列有25.2%(62/246)为DEL，62例DEL患者主要分为MCD亚型（N=24，38.7%）、OTHER亚型（N=12，19.4%）和BN2亚型（N=11，17.7%），其中MCD亚型DEL发生率最高（与外部队列一样）。DEL治疗前血浆ctDNA负荷与血清LDH水平升高、晚期、ECOG评分2-4分、高危IPI评分显著相关。虽然DEL患者和非DEL患者的治疗前ctDNA无显著差异，但DEL患者的ctDNA水平明显高于DN亚组，表明肿瘤负荷更高。此外，DEL患者的OS或PFS未显著差于非DEL患者，可能部分归因于随访时间相对较短。

在JSPH队列中，DEL与高龄占比（P=0.019）、血清乳酸脱氢酶（LDH）水平升高（P=0.027）和ABC样细胞起源（P=0.026）显著相关，而高危IPI （P=0.057）具有边际意义。

在JSPH队列中，DLBCL肿瘤组织中最常发生突变的基因包括PIM1（36.5%）、BTG2（31.3%）、BCL6（29.4%）、KMT2D（29.4%）和TP53(28.4%)；DEL组PIM1、BTG1、CD79B、MYD88、CDKN2A、MYC、KLF2、MEF2B和SF3B1的基因变异频率显著高于非DEL组，而外部队列中DEL组在PIM1（29.6%）、TP53（25.4%）、MYD88（23.9%）、CD79B（15.5%）、TBL1XR1（11.3%）、MYC（9.5%）、CDKN2A（6.7%）和PRDM1（7.0%）中表现出较高的基因改变频率，而在GNA13（9.5%）、SGK1（7.4%）和NFKBIA（4.2%）中表现出较低的基因改变频率。此外，在外部队列的单因素分析表明，PIM1、TP53、BTG1、MYC和BCL2突变对DLBCL的预后有负相关作用，而TNFRSF14、CARD11、EZH2和GNA13突变似乎与良好预后相关。

为了从突变水平解释不同基因亚型DEL患者的不良预后，分析了EZB、MCD和OTHER亚型DEL患者与非DEL患者的突变谱差异。外部队列EZB亚型中，DEL患者显示显著更高的MYC基因突变频率 (P=0.010)，但B2M (P=0.004)和CREBBP (P=0.092)的突变频率较低；在其他亚型中，DEL患者的FOXO1(12.1% vs 6.2%，P=0.082)和CD79B(9.3% vs 3.8%，P=0.053)频率较高；但在MCD亚型中，DEL和非DEL之间无基因表现出显著的突变频率差异。在JSPH队列MCD亚型中，DEL患者中FAT4（P=0.052）和KMT2D （P=0.058）的突变频率较高；在OTHER亚型中，CD83在DEL患者中的突变频率（33.3%）高于非DEL患者（2.0%）；但在EZB亚型中很少有DEL患者进行进一步的突变分析。

在外部队列DEL患者中，TP53或MYC突变与较差的OS和PFS显著相关，而CARD11或BCL10突变与较好的OS相关，CD58突变有PFS更差的趋势，而NFKBIA突变与较好的PFS相关且具有边际意义。多因素分析中，TP53和MYC对DEL患者的OS保持独立预测价值，而MYC和ARID1A对DEL患者的PFS保持独立预测价值。

为了进一步了解DEL患者的预后分层，利用外部队列数据进一步探索DEL的临床和遗传预后因素。在单因素分析中，年龄≥60岁、晚期、低ECOG评分、LDH水平升高和高危IPI评分等危险因素显著导致DEL患者的OS恶化，PFS患者也出现类似的结果。此外结外受累部位数量和COO与DEL患者的OS或PFS无显著相关性。值得注意的是，尽管BCL2/MYC双打击和BCL2单重排对DEL患者预后无明显影响，但MYC单重排对DEL患者的PFS产生不利影响（P=0.036），并且有恶化OS的趋势（P=0.058）

遗传亚型方面，MCD、A53和N1亚型患者在整个外部队列中表现出更差的PFS和OS趋势；但在DEL患者中，只有ST2表现出明显优于A53的生存期，并且与EZB亚型相比有更好的生存期趋势，而其他亚型无显著生存差异。根据总体预后影响，进一步将患者分为MCD/A53/N1、BN2/EZB/ST2和OTHER三个遗传组，尽管在整个DLBCL队列和非DEL患者中，与BN2/EZB/ST2和OTHER组相比，MCD/A53/N1组的OS和PFS较差，但在DEL患者中没有发现这种预后差异。

基于上述单因素生存分析，对DEL患者的OS和PFS进行多因素Cox回归分析。年龄≥60岁、Ann Arbor III-IV期、LDH水平升高和MYC重排四个变量对OS仍有独立的不良预后意义，而CARD11突变和BCL2重排有改善OS的倾向。另一方面，晚期和MYC重排是PFS的独立负面预后因素，LDH升高与DEL患者PFS恶化相关但仅具有边际意义，而BCL2重排对DEL患者PFS有积极影响。

为了阐明DEL的生物学机制，使用RNA-seq对JSPH队列和来自REMoDL-B研究的GSE117556进行差异表达分析。在JSPH队列中，在DEL患者中鉴定出931个差异表达基因（DEG），包括847个下调基因和84个上调基因。KEGG分析显示，下调基因在PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、细胞粘附分子、局灶粘附、TGF-β信号通路和药物代谢-细胞色素P450中显著富集。基因本体（GO）分析检测到细胞外基质组织、GTPase活化、Wnt信号通路和细胞对转化生长因子β刺激的反应下调。从整体基因表达水平来看，上调的生物学过程主要与遗传物质合成和B细胞受体信号通路相关，可能反映出DEL患者淋巴瘤细胞的活跃生长，而GSEA分析中下调的基因则富集于环磷酸腺苷（cAMP）信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Rap1信号通路和局灶黏附。免疫细胞浸润的ssGSEA分析显示，DEL患者的NK细胞、中性粒细胞和2型T辅助细胞的表达评分明显降低。

此外使用GSE117556的数据对EZB亚型DLBCL患者的DEL和非DEL进行DEG分析。与非DEL患者相比，DEL患者中表达上调的基因富集于转化生长因子β (tgf-β)信号通路、苯丙氨酸代谢、组氨酸代谢和细胞周期，表达下调的基因富集于Th17细胞分化、toll样受体信号通路、Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路、PD-L1表达、KEGG分析PD-1检查点通路和细胞粘附分子。在GO富集分析中，在DEL患者中检测到与胞外基质组织、T细胞活化和增殖、II型干扰素生成和辅助受体活性相关的生物过程下调，表明抗肿瘤免疫应答不足，可能是DEL患者预后不良的原因。与之类似，通过 GSEA 从整体基因表达水平发现遗传物质合成上调，细胞色素 P450 介导的药物代谢以及 PD-L1 表达和 PD-1 检查点通路下调。此外，与细胞死亡相关的凋亡、自噬、铁下垂、TNF信号通路均显著下调，反映出DEL患者的抗凋亡特性和不良预后。此外，ssGSEA分析提示DEL患者缺乏NK细胞、中央CD4 T细胞、效应CD8 T细胞、巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞、T滤泡辅助细胞和1型T辅助细胞。MCD亚型在突变谱上与DEL相似。

作者充分利用外部队列的临床和测序数据，并将其与JSPH 队列相结合，分析了DEL在遗传分类时代的预后意义和危险分层，探索了潜在的生物学机制。