引言[1]
巨噬细胞亚型从促发炎的 M1 型转变为抗炎/促重塑的 M2 型，这一功能变化在伤口愈合过程中起着至关重要的作用，它帮助伤口从发炎期顺利过渡到再生期。M2 巨噬细胞，作为一种抗炎和重塑的表型，可以由 M1 巨噬细胞转化而来，或者由具有混合表型的单核细胞直接发育而成，主要包括 M2a、M2b、M2c 和 M2d 亚型，其中，M2a 和 M2c 亚型的功能特征分别为促愈合和促重塑，并通过其相应的表面标记物 CD206+ 和 CD206+/CD163+ 的表达进行区分。
糖尿病足溃疡（DFUs）是一种慢性伤口，其愈合过程常因高血糖环境而受阻，导致炎症阶段延长。这种慢性发炎状态主要以 M1 巨噬细胞的持续存在为特征，同时伴随着 M2 巨噬细胞的缺乏。M1 巨噬细胞的长期存在会促使 IL-6、TNF-α 和 IL-1 家族成员持续分泌，这不仅阻碍了 M2 巨噬细胞的极化，还造成了周围组织的损伤。因此，以往的研究[2-3]表明，通过降低 M1 巨噬细胞的比例或减少促发炎信号，以重新平衡 M1/M2 比值，对于促进糖尿病足溃疡的伤口愈合具有一定的治疗潜力。
一项发表在四大医学期刊 JAMA 子刊 JAMA Network Open 杂志，涉及美、中（含中国大陆及中国台湾地区）的 III 期临床研究结果也表明，与传统亲水性纤维敷料相比，在为期 16 周的治疗期间内，新型辅料香雷糖足膏能够显著提升 DFUs 患者的总体愈合率，其完全愈合率高达 60.7%[4] 。香雷糖足膏是全球唯一获批的用于治疗 DFUs 的 1.1 类新药[5]，可通过抑制 NLRP3 炎性体的信号传导以及调节巨噬细胞功能，有效促进伤口的愈合过程[4]。为了更深入地理解其分子机制，一项探索香雷糖足膏如何调节细胞功能以及细胞网络，以进一步改善 DFUs 伤口愈合的研究由此展开，这项研究将使我们对 DFUs 涉及的巨噬细胞亚群表型有更清晰、更深入的认识。
材料与方法[1]
药物配方
在动物实验中，研究使用了有效成分为 1.25% 的香雷糖足膏和安慰剂乳膏。在体外试验中，香雷糖足膏粉末被溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，制备成浓度为 25 mg/mL 的溶液。
根据实验目的选择了 3 种不同的糖尿病动物模型：
✔ 第一种，选取 9 周龄的 db/db 小鼠，空腹血糖水平在 300～500 mg/dL 之间且体重大于 35 g。使用无菌 6 mm 活检打孔器在每只小鼠的背部制造两个全厚伤口。为固定伤口并减少皮肤收缩，在伤口上覆盖硅胶夹板（内径/外径为 10/14 mm），随后用透明闭塞性敷料覆盖。从小鼠伤口形成后的第 3 天开始，直到实验结束（即处死以进行后续分析），每天使用 1.25% 的香雷糖足膏或安慰剂乳膏对伤口进行一次局部涂抹。
✔ 第二种，高脂饮食（HFD）诱导的小鼠模型。选取 6 周龄雄性 C57BL/6 小鼠喂食含有 60 kcal 脂肪的啮齿类动物 HFD 饲料，持续 10 周。通过口服葡萄糖耐量试验评估 HFD 诱导的肥胖模型是否成功建立。成功建立的标志是 HFD 组在口服葡萄糖耐量试验后 60 分钟的平均血糖水平显著高于正常饮食对照组（平均血糖水平 = 385 mg/dL）。待 HFD 诱导的肥胖模型建立成功，将小鼠随机分为安慰剂组和香雷糖足膏处理组，并按照前述方法进行伤口处理。
✔ 第三种，在 M2 巨噬细胞耗竭实验中，选取 8 周龄的 C57BL/6N 小鼠或 db/db 小鼠，让它们食用标准饲料和水。小鼠被随机分配至两组：实验组接受甘露聚糖 Clodrosome（含有氯屈膦酸的甘露聚糖脂质体）皮下注射，对照组接受 m-Encapsome（与 Clodrosome 在结构上相似，但不含有氯屈膦酸）皮下注射，注射剂量均为 0.05 mg/kg。从伤口处理前的 7 天开始，每 2 天注射一次，直到实验结束。同样地按照前述方法进行伤口处理。
其他检测方法及使用目的简述如下：
✔ IHC 染色和定量：用于评估组织中的特定蛋白质或细胞类型。
✔ qRT-PCR（实时荧光定量聚合酶链式反应）：用于测量基因表达水平。
✔ 流式细胞仪检测小鼠皮肤免疫细胞：用于分析皮肤中免疫细胞的类型和数量。
✔ 细胞培养和 M1 及 M2 极化：用于研究巨噬细胞的不同极化状态及其功能。
✔ 流式细胞仪检测人类巨噬细胞标记物：用于识别和分析人类巨噬细胞不同亚群。
✔ ELISA（酶联免疫吸附试验）：用于测量特定蛋白质或抗体的浓度。
✔ 细胞裂解及免疫印迹：用于检测细胞内的特定蛋白质及其表达水平。
研究结果[1]
香雷糖足膏在高脂饮食诱导的糖尿病和基因肥胖小鼠这两种 DFUs 伤口愈合的动物模型中，均展现出了显著的促进愈合效果（图 1）。在这两种模型中，接受香雷糖足膏治疗的伤口在第 6 天即展现出更多的肉芽组织形成，并在第 9 天观察到更快的上皮细胞上皮化过程。这些发现强有力地表明，香雷糖足膏具有加速 DFUs 伤口愈合的潜力，且其效果不受糖尿病病理过程（无论是高脂饮食诱导还是基因肥胖导致）的影响。
图 1 香雷糖足膏可促进高脂饮食诱导的糖尿病和基因肥胖小鼠的伤口愈合
香雷糖足膏在治疗 DFUs 时，改变了伤口中巨噬细胞亚群，并调节了基因表达谱（图 2）。炎症谱的紊乱是阻碍 DFUs 伤口愈合的关键因素。利用免疫组化、免疫荧光、流式等检测方法发现，在伤口愈合过程中，中性粒细胞、成纤维细胞和 T 细胞的数量逐渐减少，而单核细胞和巨噬细胞的数量则在愈合初期有所增加，随后保持稳定。进一步分析发现，香雷糖足膏能够提升 M2 巨噬细胞的数量，从而调节炎症反应，还能调节与伤口愈合紧密相关的基因表达——具体表现为下调 M1 巨噬细胞相关基因的表达，同时上调 M2 巨噬细胞相关基因的表达。综上所述，香雷糖足膏的局部应用有助于促进 DFUs 伤口的愈合，可能通过调节炎症反应及改变巨噬细胞亚群来实现。
图 2 香雷糖足膏可调节 db/db 小鼠巨噬细胞亚型
在体外研究部分，则采用了可极化的人类单核细胞系 THP-1，分别在正常葡萄糖浓度（NG）和高葡萄糖浓度（HG）条件下诱导其极化为 M1 或 M2 巨噬细胞。研究发现，与 NG 条件相比，HG 培养的细胞中 M1 标记物（CD86 和 CD80）的比例更高；同时，在 HG 培养基中，M2 极化 M2a/c 标记物（CD163+ 和/或 CD206+）的比例则低于 NG 培养基。这说明香雷糖足膏具有直接抑制 M1 巨噬细胞极化的作用，主要通过抑制 CD80 和 CD86 的表达来实现，并且能减轻 M1 巨噬细胞相关的炎症反应。值得注意的是，M1 相关条件培养基提升了 M2 巨噬细胞的 CD80 和 CD86 的表达水平，而经过香雷糖足膏处理后，这两种标记物的表达则明显下调，这一发现提示，M1 巨噬细胞分泌的因子可能具有阻止形成有利于 M2 巨噬细胞极化的微环境的作用。因此，香雷糖足膏可能通过减轻以 M1 巨噬细胞为主导的环境，促使其转变为有利于 M2a 极化的环境。综上所述，香雷糖足膏不仅能够直接抑制 M1 巨噬细胞极化，还能逆转 M1 介导的 CD206+ M2 巨噬细胞的状态（图 3～5）。
图 3 高血糖减少 M2 巨噬细胞表现量
图 4 在 HG 条件下，香雷糖足膏可直接直接抑制 M1 巨噬细胞极化
图 5 香雷糖足膏可抑制 HG 条件下 M1 相关细胞因子的释放和基因表达
香雷糖足膏可通过增强脂肪前体细胞（ADPCs）活性，促进 M1 向 M2 巨噬细胞的转化（图 6）。与未经香雷糖足膏处理的 ADPCs 相比，经过香雷糖足膏处理的 ADPCs 培养基能够显著增加 CD206 和 CD163 的表达。由此可见，ADPCs 在香雷糖足膏诱导的促进 M1 向 M2 巨噬细胞转化的过程中发挥了重要作用。此外，香雷糖足膏能刺激 ADPCs 表达 GCSF 和 CXCL3，它们参与 M1 向 M2 巨噬细胞的转变，同时，GCSF 和 CXCL3 处理还可以激活 STAT3 信号通路和蛋白激酶 B 的磷酸化。由此可见，香雷糖足膏可以促进 ADPCs 中 GCSF 和 CXCL3 基因的表达，并进一步影响 M1 巨噬细胞的标记物转换和下游信号通路的激活。
图 6 香雷糖足膏通过 ADPCs 介导的 GCSF 和 CXCL3 的产生/分泌，促进 M1 向 M2 巨噬细胞转化
香雷糖足膏能够通过调节 M1/M2 巨噬细胞的平衡加速伤口愈合（图 7）。具体而言，香雷糖足膏对 M1/M2 巨噬细胞比率展现出双重调节作用：它既能减少 M1 巨噬细胞的数量，又能促进 M2 巨噬细胞的增殖。在实验中，给予 db/db 小鼠甘露糖基化氯膦酸盐（m-Clo）或对照脂质体（m-Enc）处理，再进行开创，随后给予小鼠香雷糖足膏或安慰剂乳膏的治疗。与安慰剂组相比，香雷糖足膏的处理显著改善了伤口愈合率；值得注意的是，当给予 m-Clo 导致 M2 巨噬细胞比例降低后，香雷糖足膏原本对伤口愈合的改善效果便受到了阻断。此外，香雷糖足膏治疗组的细胞外基质重塑蛋白平滑肌 α 肌动蛋白（α-SMA）以及 Pref-1+ 细胞明显增加，M2 巨噬细胞的剔除则减弱了此效应。局部香雷糖足膏治疗可透过刺激 ADPC 分泌的细胞因子而促进 M1 至 M2 巨噬细胞的转换。香雷糖足膏通过双重途径——减弱 M1 巨噬细胞介导的促发炎趋势和增强 M2 巨噬细胞群，促进糖尿病伤口愈合。因此，香雷糖足膏通过 M2 巨噬细胞依赖途径促进糖尿病伤口愈合。
图 7 基于 M2 巨噬细胞剔除的糖尿病小鼠模型验证：香雷糖足膏通过 M2 巨噬细胞促进伤口愈合
讨论[1]
亚群失调，特别是 M1 向 M2 巨噬细胞转化的不足，被视为是阻碍 DFUs 伤口愈合的主要因素。尽管现今 M1/M2 巨噬细胞群重塑的研究未能产生有效的解决方案，但本研究发现，香雷糖足膏能通过减少 M1 巨噬细胞极化并启动 ADPC 的双重途径，创造有利于 M1 至 M2 巨噬细胞转换的环境，有效加速糖尿病伤口愈合，同时调控巨噬细胞和 ADPC 参与的多种细胞途径促进这种转变，改变趋化因子/免疫细胞图谱，以影响促愈合 M2a 和促重塑 M2c 巨噬细胞的极化。这种机制在临床上成功地改善了糖尿病伤口的愈合率，这些结果同样证明了药用植物萃取物具有重塑巨噬细胞亚型的能力，并在促进皮肤伤口愈合方面得到了初步的概念验证。
M1 巨噬细胞释放的促炎症细胞因子 IL-1β 和 TNF-α，会导致糖尿病患者伤口炎症持续。本研究发现，香雷糖足膏能够减少 M1 相关细胞因子的产生，并且经香雷糖足膏处理后的 M1 巨噬细胞培养基能够抑制 M1 标志物的表达，从而遏制 M1 介导的慢性炎症。此外，CXCL3 能够启动 CD163，而 GCSF 能够增强代表 M2a/c 亚型的 CD206 和 CD163 标记物的表现。这些结果说明，除了已知的体外极化 M2a 的细胞因子 IL-4/IL-13 和极化 M2c 的细胞因子 IL-10 外，GCSF 和 CXCL3 可能在伤口愈合的某些情况下调节 M2a 和 M2c 的极化，这可能在调控 M2 巨噬细胞的可塑性方面发挥重要作用。
综上所述，该研究为减少伤口炎症、促进伤口愈合提供了新的证据，并对 M2 巨噬细胞亚型的功能及其可塑性提供了新的见解。同时，香雷糖足膏也是首个在全球范围内获得批准，专门用于治疗 DFUs 的 1.1 类天然药物[5]。在 2024 年发布的《糖尿病足溃疡创面治疗专家共识》中[5]，其也被推荐作为 DFUs 创面治疗的一种药物选择。
小结
该研究通过动物实验与细胞研究，从体内和体外两个角度揭示了新型敷料香雷糖足膏的独特功能。它能够抑制 M1 巨噬细胞的极化和活性来减轻慢性发炎，在加速糖尿病伤口愈合过程中表现出独特的功能。同时，香雷糖足膏可刺激 ADPC 中 CXCL3 和 GCSF 的分泌，产生有利于 M2 巨噬细胞聚集的环境。该研究结果首次证实，香雷糖足膏通过重新协调免疫细胞及其信使的分布，显著提升了 DFUs 的伤口愈合能力。因此，它有望成为治疗复杂 DFUs 的另一种可选疗法。
*本内容仅供医疗卫生人员阅读，相关内容仅供参考不作为诊疗依据
内容策划：于洋
项目审核：李阳
题图来源：图虫创意
参考文献
