根据美国的统计数据(2014年)，透明质酸凝胶(HA)和羟基磷灰石钙/羧甲基纤维素填充剂(CaHA/CMC)是注射手术中最受求美者欢迎的两种材料。其中，HA占比78%，CaHA占比11%，其余的11%包含了聚左旋乳酸(PLLA)的等其他填充材料。尽管大多数的HA填充剂都是由相同的成分(HA和1,4-丁二醇二缩水甘油醚即BDDE)组成，但由于HA原料、交联程度和制造工艺的不同，产品间存在广泛的理化特性差异。传统上衡量HA填充剂基本特征的指标是流变学参数(即材料对施加的力的无理响应)，其连同一些假设通常被用来预测填充剂的临床表现。例如，假设具有较高G’值的填充剂(即更坚固或更有弹性的)比具有较低G’值的填充剂能更好的抵抗组织压力并提供更好的提升力。事实上，虽然个别的流变学性能为理解产品间差异提供一些参考，但是受各种填充剂特性(如G’、内聚性、HA浓度、吸水性等)和应用(如注射平面、部位、注射剂量)的影响，单个流变学参数很难转化为临床性能的评估。作为流变学数据的补充，动物模型可以用来预测填充剂在生物环境中随时间变化的性能。结合动物模型的数据和流变学的理化参数，可以作为设计解决某一针对性治疗期望的材料选择参考。外国学者Hee等开发了3个新的动物模型来研究具有不同成分和理化特性填充剂间的提升力、抗性变能力和组织融合能力的差异。研究产品：本研究中评价的填充剂包括Hylacross交联技术产品(均质)--Juv´ederm Ultra Plus XC(HYC-24L+)；Vycross交联技术产品(均质)--Juv´ederm Volbella with Lidocaine (VYC-15L)、Juv´ederm Volift with Lidocaine (VYC-17L)、Juv´ederm Voluma with Lidocaine (VYC-20L)；非动物源性稳定HA(NASHA)交联技术产品(颗粒型)--Restylane-L(RES-L)、Perlane-L (PER-L)；CaHA/CMC (微球载体)产品-- Radiesse (RAD)。研究中的所有产品均含有0.3%的利多卡因。体外实验：选取每种填充剂3个不同批次的产品进行体外理化性质的测量，流变仪参数设定为5Hz、0.8%应变张力、C35/2几何角度。垂直压缩阻力通过边长25mm的平面以0.8 mm/min的速率压缩2分钟，测量过程中填充剂的正常最大张力确定。测定吸水性时，将0.1mL填充剂与0.7mL磷酸盐缓冲液混合，并在注射器中来回混合操作超过1小时。最终没有被填充剂吸收的缓冲液都用蓝染乳胶珠溶液染色，最大吸水性计算为初始凝胶百分比(12.5%)与最终凝胶百分比(非染色相的高度/凝胶和缓冲液的总高度)之间的百分比差值。为了便于显微镜观察，样品直接从注射器挤压到干净的玻片上，用抹刀轻轻涂抹，不做任何其他准备(如稀释或干燥)，并拍摄明亮的视野图像。体内实验：研究使用2-4月大的斯普拉格·道利大鼠，进行皮下平面的填充剂注射后，应用3D成像工具，比较填充剂在体内的相关特征，包括提升能力、抵抗相变的能力、与周围组织的融合能力。为了进行提升能力和抗形变能力的研究，动物在颅顶部位接受了125uL使用27G锐针进行的皮下平面团状填充。随后使用坎菲尔德Vectra M1h 3D成像系统评估填充剂的投影。在提升能力的研究中，使用上述3D系统对特定的时间点(注射后立即，注射后1天，注射后1、2、4、12周，n = 10/组)测定注射部位的平均高度。在抗形变的研究中，在注射后2天内(注射后即刻、注射后1天、注射后2天，n=6)评估施加标准力量后注射部位平均高度的下降。研究在上述时间点，在无压力状态下各先拍摄一张图像；然后将319g的机械力量(代表拇指的力)施加在注射部位上方3秒，再拍摄一张图像。抗形变能力计算为施加力量后填充剂平均高度下降的百分比。为了研究填充材料的组织融合性，研究者再动物的背部或侧翼进行注射(n=8/组/时间点)。每只动物背部接受27G锐针进行皮下200uL的团状注射，或沿皮肤纹理进行20uL的逆行注射。注射的填充物和周围组织再1周和4周切除组织，经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋后应用旋转切片机制作成切片(5mm)。切片染色摄像后由一名盲法组织病理学家进行阅片，观察填充材料周围组织的范围、填充材料和炎症细胞相结合的反应。统计分析：对于提升力能力，采用了双向重复测量方差分析，以确定填充材料之间的总体和单个时间点的差异。对于抗形变能力，采用双向方差分析，以确定填充材料随时间和在各个时间点的差异。两两比较采用Tukey的多重比较检验。差异显著性在p <0 .05时确定。体外实验：理化性质列于表1。在CaHA/CMC填充材料中，在剪应力后储存和回收的能量(G’，弹性模量)和在剪应力过程中因摩擦而消耗的能量(G”，粘性模量)中最高，其次是NASHA颗粒型填料，以上两个指标在均质填充材料中最低。作为内聚性的衡量指标，CaHA/ CMC填充材料的垂直压缩阻力也最高。研究对均质填充材料组的垂直压缩阻力进行了分层，HYC-24L+的测量值高于VYC-15L、VYC-17L和VYC-20L。NASHA颗粒型填充剂具有与均质型填充剂相似的抗压缩能力。表1同时报告了研究的填充材料最大吸水性数据，这与由于吸水而增加填充材料体积的潜力有关。在该实验中，均质型填充剂表现出不同的吸水能力，VYC-15L、VYC-17L和VYC- 20L的吸水性(100%-250%)少于HYC-24L+(425%-475%)。NASHA颗粒型填充剂比均质型填充剂吸水性更低(65%-115%）。RAD材料不适用于吸水性测量，因此严重中未做本参数的评估。各种填充剂代表性的显微图像如图1所示。均质型填充剂(图1A)是平滑的，未见交联单元及颗粒；NASHA技术的颗粒型凝胶(图1B)具有可见的交联单元及颗粒；CaHA/CMC填充剂(图1C)在CMC凝胶载体中可见CaHA颗粒。![]()
(图1)填充剂代表性的显微图像，包括(A)均质型凝胶、(B) NASHA颗粒型凝胶和(C)CaHA/CMC(放大倍数*131)。
体内实验：提升力能力数据见表2和图2。所有填充材料在注射后立即观察到了最大平均高度，之后高度随着时间的推移而下降。表2 列出了材料在研究期间不同时间点总体提升能力间的显著差异数据。均质型凝胶间平均高度随时间的变化差异见图2A，颗粒型凝胶和RAD的提升力曲线差异见图2B，图2C对比了每一种填充材料(均质型、颗粒型、RAD)弹性模量G’值最高的产品其平均高度随时间的变化曲线。![]()
(图2)(A)均匀型HA凝胶、(B)颗粒填充剂(NASHA和CaHA/CMC)和(C)弹性模量G’值最高的产品在注射后12周内平均高度的变化对比。
抗形变的测量数据如图3所示。所有HA填料在注射后产生的即刻抗变形阻力都相对较低(32.4%–40.5%)，平均高度下降的百分比较高，且随着时间的推移，HA组的抗形变阻力显著增加(p＜0.318）。相反，RAD在注射后即刻具有较高的抗形变阻力(14.1%），并与所有时间点的其他产品组均有显著差异（p＜0.001），且在实验过程中数值没有显著变化。![]()
(图3)真皮填充剂的抗形变能力(平均高度下降百分比[mm/mm 6标准偏差])。*与RAD相比显著增加(p＜0.001）；†与第0天相比，组内显著降低(p＜0.032)；‡与第1天相比显著降低(p＜0.002)。
分别在注射后1周和4周评估填充材料的组织融合情况。VYC-20L和PER-L作为皮下团状注射填充进行评估，临床操作时两者的注射深度一致(图4)。VYC-20L早在注射后1周就出现了一些宿主组织的生长，并在4周时发现有明确的胶原组织分布在整个注射填充物中；在注射后1周和4周，PER-L观察到的组织生长情况比VYC-20L更复杂，一些区域显示组织生长，而其他区域显示组织缺失。![]()
(图4)注射后4周，(A) VYC-20L和(B) PER-L的皮下组织融合。蓝色为HA填充材料，红色为胶原蛋白、棕色为肌肉。
HYC-24L+、VYC-15L、VYC-17L、RES-L、RAD通过皮内沿皱纹浅层进行注射(图5)。在1周(数据未显示)和4周(图5，A-C)时，HYC-24L+、VYC-15L和VYC-17L均分布在真皮组织的间隙中。RES-L在真皮组织中观察到不同的空间分布，有一些融合区域和一些大的组织聚集物(图5D)。在第4周时，RAD在组织内的分布较少（图5E）。巨噬细胞和淋巴细胞的浸润情况，在1周和4周时从轻微到严重不等。![]()
(图5)染上4周后，(A) HYC-24L+、(B) VYC-15L、(C) VYC-17L、(D) RES-L和(E) RAD的皮内组织融合情况。蓝色为HA填充材料，红色为胶原蛋白、棕色为肌肉。
软组织填充物的设计是为了提升组织和增加体积，以改善皱纹/褶皱、或在衰老过程中失去的体积的美学外观。虽然物理化学性质(如流变学、HA浓度、吸水性等)是测量填充剂之间差异的有效方法，但它们很难转化为临床性能，因为填充材料的性质可能会随着时间的推移随着与组织环境的相互作用而发生变化。因此，本研究开发的动物模型可以用来评估具有不同物理化学性质的各种填充材料的相关性能属性，以更好地评估生物环境随时间的影响，并预测材料特定适应症的临床性能。了解提升能力对于预测填充材料作为容量补充剂还是组织提升物至关重要。提升能力更大的填充材料在需要凸度的体积化部位应用中更有用，而提升力小的材料适合更表面的应用，包括填充皱纹或细纹。本研究在单独比较基于升力的容积化填充材料时，发现VYC-20L的提升力更大，HYC-24L+、VYC-17L、VYC-15L、RES-L等填料的提升能力较低，更符合填充皱纹的临床指征。在既往的研究中，G’一直被用来预测和描述填充材料的提升能力。在评估本研究测试产品的流变学特性时，G’和G”在不同成分的产品中(即CaHA/CMC >> 颗粒型HA凝胶>均质型HA凝胶)表现不同。根据G’的结果应提示，CaHA/ CMC填充剂的提升能力最大，而均质型HA凝胶的提升能力最低，但实际到的提升能力没有遵循相同的趋势(图2C)。当将所有的填充物当作一个组别来观察时(图6虚线)，发现提升力与G’的增加无关。当在制作工艺相同的填充材料做同组观察时，G’的增加与总体提升能力呈正相关(图6，实线或虚线)。其他的物理化学参数(G”、垂直压缩力、HA浓度)的评估，无论是在所有的填充剂或是类似交联技术填充剂组内(数据未显示)，均没有显示出与整体提升力一致的关系。![]()
(图6)整体提升力与G’的关系图。对于具有类似成分/交联技术的产品(均质型VYC凝胶[实线]和颗粒型NASHA凝胶[虚线])和所有产品组合(虚线)，总体提升力(表2)和G’(表1)之间的线性关系。
这一分析表明，除了物理化学参数外，其他参数也会影响填料的性能，比如填充材料的成分。例如，RES-L、PER-L和RAD是颗粒型填充材料，它们最初表现出很强的提升能力，但从第1天开始下降(表2和图3B)。填充材料载体的存留无法通过流变仪进行测量，但其可能会随着时间的推移影响提升的能力。与除VYC- 20L外的所有组相比，HYC-24L+填料具有更高的相对吸水性，从第1天到第2周表现出更大的提升能力。但在注射2周以后，填充剂预计不会继续吸水，HYC-24L+的提升力下降，导致在12周时的提升力明显低于VYC-20L和PER-L。抗形变能力也是填充材料的一个重要属性，它与填料的形态以及经塑形后达到的预期效果相关。抗形变的能力是物理化学性质的函数，内聚性是其中一种。临床中观察到的即刻变形阻力(即从用力前后下降的百分比)与测量到的内聚性一致。在本研究中，CaHA/CMC填料的抗形变能力明显增强，其内聚性是其他材料的3-12.5倍。在本研究的动物模型中，观察到的早期时间点的抗形变阻力相对较低，这与临床观察结果中描述的VYC-20L和VYC-15L易于塑形和按压相一致。与RAD相比，HA填充剂在所有时间点都具有较高的抗形变阻力，并随着时间的推移而增强。值得注意的是，在1天和2天的时间点观察到一定程度的变形，这表明一定程度的延展性保持。随着时间的推移，抗变形能力的变化可能是由于填充剂与组织的相互作用引起，包括吸水和填料的分布/整合。不同内聚性能产品的选择主要取决于适应征。例如，在容积化应用中(即骨膜上或皮下注射)，可能需要更高的抗变形阻力的产品，以防止填充剂的扩散，导致体表投影的损失。当注入平面变得更浅时，与较低的抗形变能力(可塑性和可扩展性)相关的产品更可取。与其他各组相比，VYC-20L的可塑性随时间变化最大，表明其在体积化应用中表现良好。相反，除RAD外，其余与VYC-20L相比第1、2天变形阻力更低的产品，则可能在中深度和浅深度应用中有用。RAD是这些产品中的一个特殊存在，因为注射即刻的抗形变阻力相对较高，并且没有随时间变化，这可能限制其在高度移动区域(如嘴唇)或解剖上不敏感的区域(如眼周区域)的使用有关。本研究观察了填充物分布或整合周围组织的能力，这可能与填充物在组织内的外观和感觉有关。例如，和与组织分离的填充物(颗粒型凝胶RES-L、RER-L和RAD)相比，均质型填充剂(HYC-24L+、VYC-20L、VYC-17L、VYC-17L、VYC-17L和VYC-15L)在注射后1周和4周时的分布和整合模式不同，其均匀分布在组织内(皮内注射)或与周围组织融合(皮下注射)，因此看起来和感觉上更像天然的组织。综上所述，本研究使用动物模型结合流变学参数来评估填充材料的性能属性，对临床根据不同的适应症选择最合适的填充材料具有参考意义。本研究表明仅凭理化特性(G’等)不足以完全预测填充材料真实的临床表现。Christopher K Hee，Garrett T Shumate，Vic Narurkar，Aude Bernardin，Darin J Messina.Rheological Properties and In Vivo Performance Characteristics of Soft Tissue Fillers.Dermatol Surg.2015 Dec:41 Suppl 1:S373-81. doi: 10.1097/DSS.0000000000000536.![]()
